$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка буфера
- Меченый буфер (2x фосфатно-солевой буфер, (PBS), pH 7,9): в 400 мл дистиллированной деионизированной (DD) воды добавьте 100 мл 10x PBS, отрегулируйте pH до 7,9 с помощью гидроксида натрия (NaOH).
- 3 мМ биотина: растворите 1 мг биотина в 588 мкл меченого буфера.
- 3 мМ Sulfo-tag: Растворите 150 нмоль Sulfo-tag в 50 мкл буфера для мечения.
- Антигенный буфер (5% БСА): В 500 мл 1x PBS добавьте 25 г бычьего сывороточного альбумина (BSA).
- Приготовьте 0,5 М раствора уксусной кислоты.
- 1,0 М буфера Tris-HCl pH 9,0: Приготовьте 1 М буфера Tris-HCl и отрегулируйте pH до 9,0 с помощью HCl.
- Буфер для покрытия (3% блокатор А): В 500 мл 1x PBS добавьте 15 г блокиратора А.
- Буфер для стирки (0,05 % Tween 20, PBST): В 5000 мл 1x PBS добавьте 2,5 мл Tween 20.
- Буфер для считывания (2x буфер для чтения T с поверхностно-активным веществом): В 500 мл воды DD добавьте 500 мл 4x буфера для чтения T с поверхностно-активным веществом (Таблица материалов).
- Хранить Биотин и Сульфо-таг в морозильной камере при температуре -20 °C. <бр/>
заметка: Растворы Биотина и Сульфо-тага всегда должны быть свежими непосредственно перед процедурой маркировки.
2. Пометьте аутоантиген островка человека биотином и Sulfo-tag
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая концентрация антигена, ≥0,5 мг/мл, рекомендуется для более эффективной реакции мечения.
- Определите молярное соотношение островкового аутоантигена человека для биотина и Сульфо-тага.
- Получить молярное число антигена можно путем деления массы антигена на молекулярную массу.
- Используйте молярное соотношение 1:5 для антигена с меньшей молекулярной массой (≤10 кД) и молярное соотношение 1:20 для антигена с большей молекулярной массой (>50 кД).
- Рассчитайте объем для Биотина или Сульфо-тага, разделив молярное число на его концентрацию.
- Смешайте островковый аутоантиген человека с Биотином или Сульфо-тагом с молярным соотношением 1:5,<бр/>
заметка: Белок в трис- или глициновых буферных системах должен быть заменен на 2-кратный PBS-буфер с pH 7,9 с использованием калибровочной спиновой колонки.
- Поскольку Биотин и Сульфо-таг чувствительны к свету, накройте реакционные пробирки алюминиевой фольгой. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч.
- Во время инкубации заправьте спиновую колонну, трижды дозируя 2x PBS буфер в колонку. Центрифугируйте раствор при 1000 x g в течение 2 мин каждый раз.
заметка: В настоящее время реакция мечения через мост все еще происходит и должна быть остановлена.
- Остановите реакцию мечения, очистив меченый островковый аутоантиген человека. Для очистки пропустите аутоантиген через спиновую колонку и центрифугируйте колонку при 1000 x g в течение 2 минут.
- Определите меченую концентрацию антигена (μг/μл) с использованием количества антигенного белка и конечного объема.
заметка: Грубо говоря, будет сохраняться 90 - 95% меченого антигена после каждого прохождения спиновой колонки.
- Аликвотировать меченый антиген и хранить меченый антиген при температуре -80 °С.
3. Определите наилучшие концентрации и соотношения для двух меченых антигенов для анализа (анализ по шахматной доске)
- Подготовьте два образца сыворотки, один с высоким положительным результатом и один отрицательный, общим объемом 200 мкл для каждого.
- Добавьте 4 мкл сыворотки и добавьте 1x PBS до тех пор, пока конечный объем не составит 20 мкл на лунку для 96-луночного планшета полимеразной цепной реакции (ПЦР). Используйте половину планшета для образца с высоким уровнем положительного результата, а другую половину – для отрицательного образца, как показано на рисунке 1A.
- Добавьте 10 мкл биотина и 10 мкл меченного Sulfo-tag антигена и проведите серийные разведения двух по-разному меченых антигенов, как показано на рисунке 1A. Запустите горизонтальное серийное разведение для одного меченого антигена и вертикальное серийное разведение для другого меченого антигена.
- Продолжайте остальные этапы анализа, описанные в пунктах с 5.3 по 9.1.
- Рассчитайте отношение сигналов из выборки с высоким уровнем положительного результата к каждому из соответствующих сигналов из отрицательной выборки, показанной на рисунке 1B.
- Определите наилучшие концентрации антигенов, меченных биотином и сульфо-меткой, выбрав точку с самым высоким или почти самым высоким соотношением положительных и отрицательных. Учитывайте низкий фоновый сигнал от отрицательной пробы, чтобы определить соотношение.
заметка: День 1 анализа включает в себя Шаг 4 - Шаг 6.
4. Приготовьте антигенный буфер, используя правильную концентрацию антигена, меченного биотином/сульфо-меткой
- Подбирайте рациональную концентрацию каждого антигена на основе анализа на шахматной доске.
- Приготовьте 3 мл раствора антигена на планшет, используя рациональную концентрацию меченого антигена Biotin/Sulfo-tag для антигенного буфера.
5. Инкубация образцов сыворотки с меченым антигеном
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе есть два протокола, один без обработки сывороткой кислотой, а другой с обработкой сывороткой кислоты. Для всех анализов на островковые аутоантитела, за исключением анализа на аутоантитела к инсулину (IAA), используется обычный протокол без обработки сывороткой кислотой с этапов 5.1 по 5.5, в то время как анализ IAA пропускает эти этапы и использует протокол с обработкой сывороткой кислотой с этапов 5.6 по 5.9.
- Добавьте 4 мкл сыворотки и добавьте 1x PBS до тех пор, пока конечный объем не составит 20 мкл на лунку для 96-луночного ПЦР-планшета.
- Добавьте 20 мкл меченого раствора антигена на лунку.
- Накройте ПЦР-планшет герметизирующей пленкой, чтобы избежать попадания света.
- Поставьте тарелку на шейкер (низкая скорость) при RT на 2 часа.
- Поставьте тарелку в холодильник при температуре 4 °C и выдерживайте в течение ночи (18 - 24 ч).
заметка: Следующий протокол шагов с 5.6 по 5.9 предназначен только для анализа IAA, а другие анализы на аутоантитела пропускают эти этапы.
- Смешайте 15 мкл сыворотки с 18 мкл 0,5 М уксусной кислоты для каждого образца сыворотки. Инкубируйте эту смесь при RT в течение 45 минут.
- Готовят раствор антигена с рациональной концентрацией биотина и меченого Сульфо-тагом антигена, на основе шахматного анализа, с использованием антигенного буфера. В каждую лунку аликвотируют 35 мкл антигенного буфера, содержащего Биотин и меченый Сульфо-Таг антиген, в новую ПЦР-тарелку.
- Перед завершением 45-минутной стадии инкубации (шаг 5.6) добавьте 8,3 мкл буфера 1 М Трис pH 9,0 на боковую сторону каждой лунки на антигенной пластине (шаг 5,6). Важно ограничить смешивание между Трис-буфером и антигеном. Немедленно перелейте по 25 мкл сыворотки, которая обрабатывается кислотой, на шаге 5.6 в каждую лунку и перемешайте раствор. Накройте ПЦР-планшет герметизирующей пленкой, чтобы избежать попадания света.
- Поставьте тарелку на шейкер (на низкой скорости) в режим RT на 2 ч. Поставьте тарелку в холодильник при температуре 4 °C и дайте тарелке инкубироваться в течение ночи (18 - 24 ч).
6. Подготовьте стрептавидиновую пластину
- Возьмите пластину со стрептавидином из холодильника с температурой 4 °C и дайте пластине прийти в режим RT.
- Как только стрептавидиновая пластина окажется в состоянии RT, добавьте 150 мкл 3% блокатора А в каждую лунку.
- Накройте ПЦР-планшет герметизирующей пленкой.
- Инкубируйте тарелку в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи. <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: День 2 анализа включает в себя Шаг 7 - Этап 9.
7. Перенос сыворотки/антигена инкубируется на стрептавидиновую пластину
- На следующий день достаньте из холодильника пластину со стрептавидином и выбросьте буфер из тарелки. Положите на стол несколько сухих бумажных полотенец и постучите по тарелке вверх дном, пока внутри лунок больше не останется буфера.
- Заполните пустую пластину со стрептавидином 150 μл PBST на лунку и выбросьте PBST с пластины в общей сложности на три промывки.
- Переведите 30 μл инкубации сыворотки/антигена на лунку в планшет со стрептавидином.
- Накройте тарелку фольгой, чтобы избежать попадания света. Встряхивайте тарелку при низкой температуре RT в течение 1 часа.
8. Вымойте пластину и добавьте буфер для чтения
- Выбросьте инкубации из тарелки. Добавьте 150 μL PBST на лунку и выбросьте PBST из планшета в общей сложности на три промывки.
- После промывки добавьте 150 μL на лунку буфера для чтения.
заметка: Важно предотвратить образование пузырьков воздуха в растворе, так как это повлияет на то, как считывается пластина на считывателе пластин .
