Бумажный иммуноферментный анализ для определения иммуноглобулина G

Аннотация

Источник: Peng, Y. et al., Ковалентное связывание антител с целлюлозными бумажными дисками и их применение в колориметрических иммунологических анализах невооруженным глазом.J. Vis. Exp. (2016)

В видео демонстрируется бумажный иммуноферментный анализ, включающий аминокислотно-функционализированные целлюлозные диски, сшитые глутаральдегидом. Ковалентная иммобилизация IgG-Fc-специфичных антител захвата с последующим введением иммуноглобулина G и конъюгированных с хреном детекционных антител к пероксидазе приводит к изменению цвета, подтверждающему наличие иммуноглобулина G.

Протокол

1. Функциональные группы аминов для прививки на дисках из целлюлозной бумаги

1. Подготовьте один лист квадратной бумаги размером от 1 см × 1 см, и 100 бумажных дисков из целлюлозной бумаги сорта No1 диаметром 6,0 мм (фильтровальная бумага средней плотности) с помощью дырокола.
2. Чтобы получить -NH₂ группы на бумажных дисках, смешайте 1 мл 3-аминопропилтриметоксисилана (APS) и 10 мл ацетона в стеклянном флаконе объемом 50 мл в вытяжном шкафу. Добавьте бумажные диски в свежеприготовленную смесь реагентов APS и инкубируйте в течение 5 ч при орбитальном перемешивании (200 об/мин) при комнатной температуре. <бр/> осторожность: Ручка APS и ацетона в вытяжном шкафу.
3. Излишки раствора сцедите из стеклянной бутылки объемом 50 мл в контейнер для органических отходов.
4. Добавьте 10 мл ацетона в стеклянную бутылку, хорошо перемешайте и полностью сцедите, чтобы удалить любые непрореагировавшие АФС и другие загрязнения. Повторите этот шаг два раза.
5. Разложите бумажные диски на бумажном полотенце и поставьте в духовку при температуре 110 °C на 3 часа. Дайте бумажным дискам остыть. Храните диски в центрифужной пробирке объемом 50 мл при комнатной температуре.
6. Используйте инфракрасную спектроскопию с преобразованием Фурье (ИК-Фурье) для проверки прививки аминных групп на целлюлозной квадратной бумаге, как описано ниже (Рисунок 1A).
   1. Включите компьютер и откройте прибор для ИК-Фурье спектроскопии.
   2. Откройте программу для ИК-Фурье спектроскопии.
   3. Перейдите в раздел «Измерение → инициализация». Прямоугольники для 'BS: KBr', 'Lamp: Infrared' и 'Laser' станут зелеными после завершения инициализации.
   4. Выберите «Данные» под прямоугольниками и выберите «%Transmittance», «Happ-Genzel», «45», «4.0» и «Min: 400, Max: 4000» для «Mode Mode», «Apodization», «No. of Scans», «Resolution» и «Range (cm-1)».
   5. Нажмите «Измерить».
   6. Выберите «Файл данных» для отображения фоновых данных. Запишите комментарии.
   7. Нажмите 'BKG', чтобы получить базовую линию для фона.
   8. Закрепите квадратную бумагу на держателе для образцов пленки.
   9. Выберите «Файл данных» для образца данных. Запишите комментарии.
   10. Нажмите «Образец», чтобы получить спектры для образца.
   11. Закройте программу ИК-Фурье спектроскопии и выключите компьютер.
7. Повторите описанные выше шаги (шаги с 1.1 по 1.6) для приготовления квадратной бумаги и дисков из целлюлозы марки 113 с аминной функционализацией (светофильтровальная бумага с быстрым течением) и получите спектры ИК-Фурье спектров для квадратной бумаги марки No 113 (рис. 1B).

2. Бумажный иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения иммуноглобулина G (IgG)

1. Добавьте 5 мл 0,05% раствора глутарового альдегида (приготовленного в буфере PBS 50 мМ, pH 7,4) в стеклянный флакон объемом 20 мл. Погрузите в этот раствор 15 дисков фильтрующей бумаги со средним расходом, функционализированных амином, и выдержите в течение 1 часа, встряхивая при комнатной температуре.
   1. Одновременно повторите шаг 2.1 для подготовки еще 15 функционализированных альдегидных фильтровальных бумажных дисков с быстрым потоком.
      осторожность: Обработайте глутаральдегид в вытяжном шкафу.
2. Чтобы удалить непрореагировавший глутаральдегид с бумажных дисков, поместите 15 дисков фильтрующей бумаги со средним потоком в центрифужную пробирку объемом 15 мл, а 15 дисков из фильтровальной бумаги с быстрым потоком — в другую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 5 мл воды DI в каждую пробирку и встряхивайте пробирки в течение 10 секунд. Удалите воду путем аспирации с помощью пипетки. Повторите два раза, чтобы удалить непрореагировавший глутаральдегид.
3. Высушите бумажные диски в духовке при температуре 37 °C.
4. Добавьте 5 мкл и 8 мкл антител IgG-Fc мышей с концентрацией 0,025 мг/мл к каждому из фильтровальных бумажных дисков со средним и быстрым потоком, соответственно, и инкубируйте в течение 20 мин.
5. Добавьте 10 мкл 50 мМ PBS (pH 7,4) в каждый бумажный диск, не удаляя антитела, и инкубируйте в течение 40 минут для реакции аминового альдегида.
6. Промойте бумажные диски с 0,2 мл буфера для стирки поверх бумажного полотенца. Повторите стирку три раза.
7. Высушите бумажные диски в духовке при температуре 37 °C.
8. Заблокируйте бумажные диски 15 мкл блокирующего буфера на 10 минут при комнатной температуре.
9. Промойте каждый бумажный диск с 0,2 мл буфера для стирки поверх бумажного полотенца. Повторите стирку три раза.
10. Запуск стандартов IgG.
    1. Загрузите 10 мкл различных концентраций IgG (например, 0, 10, 125, 250 и 500 нг/мл в PBS) на каждый диск в трех экземплярах. Выдерживать в течение 1 часа при комнатной температуре.
11. Промойте бумажные диски с 0,2 мл буфера для стирки поверх бумажного полотенца. Повторите стирку три раза.
12. Загрузите 10 мкл конъюгированных антител IgG-Fc мыши HRP (1:10 000, 10 мМ PBS, pH 7,4) и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре.
13. Промойте бумажные диски с 0,2 мл буфера для стирки поверх бумажного полотенца. Повторите стирку три раза. <бр/> заметка: Нет необходимости снимать промывочный буфер, так как наличие буфера не влияет на результат.
14. Загрузите на каждый диск смесь TMB и перекиси водорода объемом 10 μл.
15. Сфотографируйте все бумажные диски с помощью цифровой камеры или смартфона через 5 минут после инкубации.
    заметка: На рисунке 2A «0» обозначает бумажные диски, обработанные иммобилизацией антител захвата, и раствор антитела HRP/TMB без сыворотки IgG.
16. Проанализируйте интенсивность каждого бумажного диска на изображении с помощью рисунка J.
    1. Преобразуйте изображения, сделанные на шаге 3.15, в формат '.tif'.
    2. Откройте программу 'Image J'.
    3. Перейдите в раздел «Файл → открыть», выберите изображение для анализа.
    4. Выберите форму кнопки 'Овал'.
    5. Перейдите в раздел «Изображение → тип → 32 бит».
    6. Перейдите в раздел «Редактировать → инвертировать».
    7. Перейдите в раздел «Анализ → измерение».
    8. Скопируйте и проанализируйте данные в электронной таблице.

Результаты

Рисунок 1.Инфракрасные спектры с преобразованием Фурье (FTIR) необработанной и обработанной APS среднепоточной фильтровальной квадратной бумаги (А) и быстротекущей фильтровальной квадратной бумаги (В). А. Спектры необработанной фильтровальной бумаги со средним расходом были аналогичны спектрам квадратной бумаги со средним расходом, обработанной APS. Увеличение интенс...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Целлюлозная фильтровальная бумага, Класс 1 (фильтровальная бумага со средним течением)	GE Healthcare Pte Ltd Сингапур	1001 110
Целлюлозная фильтровальная бумага, Grade 113 (Светофильтровальная бумага с быстрым потоком)	Sigma-Aldrich, Сингапур	1113-320
3-Аминопропилтриметоксисилан	Sigma-Aldrich, Сингапур	Т1255	>96%
Глутаральдегид	Sigma-Aldrich, Сингапур	Г6257	Класс II, 25% H2O
Альбом с бычьей сывороткой	Sigma-Aldrich, Сингапур	А2153
Сухое обезжиренное молоко	Луи Франсуа		Упаковано кухонными каперсами, Сингапур
База Tris	Компания Promega	Н5135
Периодат натрия	Мерк	106597
На2НПО4	Мерк	106585
КХ2ПО4	Мерк	104873
NaCl	КАЛЬБИОХИМ	567441
НаОХ	Мерк	106462
список совместимого оборудования	Мерк	100317
Фосфатный буферный раствор (PBS)	Н/Д	Н/Д	PBS, содержащий 137 ммоль/л NaCl, 2,7 ммоль/л KCl, 8,0 ммоль/л Na2HPO4 и 1,5 ммоль/л KH2PO4, готовят на воде и доводят до pH 7,4 с 0,1 моль/л NaOH или 0,1 моль/л HCl
ацетон	Tee Hai Chem Pte Ltd Сингапур	9005-68
Смесь ТМБ и раствора перекиси водорода	Решение 1-Step ultra TMB-ELISA , Thermo Scientific Pierce	No 34029 (Английский	1 л
Антитело Affinity очищенного козьего покрытия против мышей IgG-Fc	Бетил Лабораториз, Инк	А90-131А
Референсная сыворотка для мышей	Бетил Лабораториз, Инк	РС10-101-5	9,5 мг/мл
HRP конъюгированное козье антитело к мышиному обнаружению IgG-Fc	Бетил Лабораториз, Инк	А90-131П
оборудование
Инфракрасный спектрофотометр с преобразованием Фурье	Shimadzu IR Prestige-21	Н/Д
печь	НЮВЕ FN500	Н/Д
Турбомиксер ВМ-2000	ООО «МЖК»	Н/Д
Изображение J	RGB, скачать бесплатно	Н/Д

гг. )