1. Образование биопленки C. tropicalis
- Приготовьте биопленки Candida в 96-луночном полистирольном микротитровальном планшете, как описано ранее (рис. 1).
- Добавьте 100 мкл культуры C. tropicalis (из 10 6 клеток/мл, приготовленного как указано выше) в 96-луночный микротитровальный планшет с помощью многоканальной пипетки (рис. 2A). Сохраняйте последние две колонки (11 и 12) в качестве негативного контроля «без грибка плюс сыворотки» и «без грибка и без сыворотки», не добавляя грибковые клетки. Заполните колонки 11 и 12 100 мкл среды 1640 морфолинпропансульфоновой кислоты (MOPS) Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI).
- Накройте микротитровую пластину крышкой и алюминиевой фольгой. Инкубируйте планшет в течение 24 часов при температуре 37 °C в стационарных условиях.
- На следующий день осторожно отсасывайте среду с помощью многоканальной пипетки (не касаясь и не разрушая биопленки). Осторожно постучите по пластине в перевернутом положении по промокательным листам, чтобы удалить остатки среды.
- Промойте планшет 200 мкл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) (на лунку) с помощью многоканальной пипетки. Добавьте PBS очень аккуратно вдоль боковых стенок лунки, чтобы не повредить биопленки. Осторожно отасывайте PBS с помощью многоканальной пипетки. Повторите промывку PBS 2 раза (всего три промывки).
- Чтобы удалить излишки PBS, высушите пластину (без крышки) на воздухе в течение 30 минут при комнатной температуре в шкафу биологической безопасности.
2. Обработка биопленки антителами
ПРИМЕЧАНИЕ: Биопленки теперь могут быть обработаны для оценки ингибирования созревания биопленки антителами. В качестве источника поликлональных антител использовалась мышиная сыворотка. Различные группы Sap2-иммунизированных (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis и Sap2-parapsilosis) вместе с симуляционно иммунизированными мышами обескровливали ретроорбитально и выделяли сыворотку. Наличие антител к Sap2 было подтверждено с помощью Sap2-специфического иммуноферментного анализа (ИФА).
- Перед применением проводят тепловую инактивацию сыворотки (источника поликлональных антител) при 56 °С в течение 30 мин для исключения роли комплемента в ингибирующей активности. Нагрейте сыворотку перед разбавлением сыворотки.
заметка: Используйте сыворотку от фиктивно иммунизированных мышей, преиммунных мышей и сыворотку с истощенными Sap2-специфическими антителами сыворотку в качестве дополнительного контроля. Сыворотка, обедненная антителами, была приготовлена в соответствии с предыдущим исследованием. Среди серийных разведений (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 и 1:12,800) для сыворотки, протестированной в этом протоколе, ингибирование созревания биопленки наблюдалось в 1:25, 1:50 и 1:100; Следовательно, 1:50 был выбран для достижения баланса между ингибированием и потреблением сыворотки.
- Готовьте серийные разведения термоинактивированных образцов сыворотки в стерильной среде RPMI 1640 MOPS (1:50). Используйте обычное разведение сыворотки (1:50) для всех образцов сыворотки, которые должны быть исследованы на ингибирование созревания биопленки.
- Добавьте 100 мкл выбранного сывороточного разведения в каждую лунку 96-луночного микротитровального планшета. Для каждого образца добавьте разведения сыворотки в двух экземплярах, как указано в прилагаемой схеме (Рисунок 2B).
- В столбце 10 не добавляйте разбавление сыворотки; добавляйте только среду RPMI 1640 MOPS для положительного контроля грибка.
заметка: Столбец 10, строки G1-G8 и H1-H8 изначально содержали грибковые клетки в RPMI-MOPS. Однако, в то время как RPMI-MOPS был добавлен в столбец 10 даже через 24 часа, строки G1-G8 служили контролем PBS, а строки H1-H8 — контролем без сыворотки после 24 часов.
- В столбце 11 добавьте разведение сыворотки в соотношении 1:50 во все лунки, чтобы обеспечить отрицательный контроль на отсутствие грибка и сыворотки.
- В столбце 12 не добавляйте разбавленную сыворотку в лунку; оставьте это значение в качестве отрицательного контроля «Нет грибка нет сыворотки».
- Накройте тарелку крышкой и алюминиевой фольгой. Инкубируйте планшет в течение 24 ч при 37 °C.
3. Оценка метаболической активности биопленки
- На следующий день осторожно аспирируйте сыворотку с помощью многоканальной пипетки (не касаясь и не нарушая биопленки). Аккуратно постучите по пластине в перевернутом положении на промокательных листах, чтобы удалить остатки сыворотки.
- Промойте планшет 200 мкл 1x PBS (на лунку) с помощью многоканальной пипетки, добавляя PBS вдоль боковых стенок лунки, чтобы избежать разрушения биопленок. Осторожно отсадите PBS с помощью многоканальной пипетки и повторите промывку PBS 2 раза (всего три промывки). Высушите пластину на воздухе (без крышки) в течение 30 минут при комнатной температуре в шкафу биологической безопасности, чтобы высушить излишки PBS.
- Приготовление XTT(2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолиум-5-карбоксанилид)/менадиона:
- Приготовьте XTT в стерильном Ringers Lactate в виде раствора 0,5 г/л. Растворите 25 мг XTT в 50 мл стерилизованного фильтром лактата Ringers. Аликвоту 10 мл в отдельные пробирки накрыть алюминиевой фольгой и хранить при температуре -80 °С.
- Приготовьте менадьон в виде бульона по 10 мМ. Растворите 8,6 мг менадиона в 5 мл ацетона и распределите 50 мкл в 100 отдельных микропробирках. Хранить аликвоты при температуре -80 °C.
- Приготовьте раствор XTT/менадиона непосредственно перед применением, взяв 10 мл XTT и добавив 1 мкл менадиона для получения рабочего раствора 1 мкМ.
- Добавьте 100 мкл раствора XTT/менадиона на лунку 96-луночного микротитровального планшета. Накройте тарелку крышкой и алюминиевой фольгой. Выдержите тарелку в течение 2 ч при температуре 37 °C в темноте.
- Перелейте 80 мкл цветной надосадочной жидкости из каждой лунки в свежий 96-луночный планшет. Считывание показаний на пластине при 490 нм.
- Рассчитайте среднее значение значений абсорбции лунок в столбце 10 (положительный контроль только для грибка), которое будет служить эталонным значением для расчета процента ингибирования биопленки каждым образцом сыворотки с использованием уравнения (1).
% Ингибирование биопленки = 100 - 
> × 100 (1)
