Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка
- Приготовьте 10 л фосфатно-солевого буфера (PBS): 32,27 г гидрофосфата натрия (Na2HPO4·12H2O), 4,5 г дигидрофосфата натрия (2PO4·2H2O), 80,0 г хлорида натрия (NaCl) добавьте в ультрачистую воду до конечного объема 10 л. Храните раствор при комнатной температуре (RT).
- Приготовьте 200 мл PBS-T: 200 мл PBS на стадии 1.1 со 100 мкл полиоксиэтилена (10) октилфенилового эфира до конечной концентрации 0,05% (об. об.). Храните в RT.
- Надев перчатки и защитные очки, приготовьте 50 мл 15% сахарозы в 10% буферизованном растворе нейтрального формалина: 7,5 г сахарозы добавьте к 10% буферизованному раствору нейтрального формалина (Таблица материалов) до конечного объема 50 мл. Магазин по адресу RT.
осторожность: Вдыхание и/или контакт с формальдегидом на кожу/в глазах в 10% буферизованном нейтральном растворе формалина может быть опасным. Обращайтесь с осторожностью.
- Приготовьте 1,5 мл 200 ЕД/мл фаллоидин-флуоресцентного конъюгата красителя: фаллоидин-флуоресцентный конъюгат (300 ЕД в 1 флаконе, лиофилизированные твердые вещества, длины волн возбуждения и излучения: 581 нм и 609 нм соответственно) суспендированный в 1,5 мл метанола. Храните раствор в темноте при температуре -20 °C.
- Приготовьте 5 мг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид (DAPI) стоковый раствор: 10 мг DAPI в 2 мл N, N-диметилформамида (DMF). Храните раствор в темноте при температуре -20 °C.
- Приготовьте 5% бычий сывороточный альбумин (БСА) в PBS: 0,5 г BSA, 10 мл PBS. Хранить при температуре 4 °C.
- Снимите скошенный кончик прямой иглы 18-го калибра с помощью кусачки и зажмите зажатый конец щипцем в продольном направлении, чтобы жидкость могла протекать через просвет иглы (рис. 1A1).
заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь.
2. Вскрытие и выделение тощей кишки у животных
- Перфузионная фиксация мыши
- Надевайте перчатки и работайте в хорошо проветриваемом помещении.
- Приготовьте стеклянный стакан объемом 100 мл, 10% буферный раствор нейтрального формалина, хирургические инструменты (ножницы, щипцы), металлический лоток, нейлоновые швы 6-0, прямую иглу 18-го калибра, приготовленную как в 1,7, крылатую иглу 22-го калибра, шприц 20-мл.
- Загрузите 20 мл 10% буферизованного нейтрального раствора формалина из стеклянного стакана в шприц объемом 20 мл и прикрепите крылышко 22-го калибра к выпускному отверстию.
- Приготовьте жидкий желатин, добавив 1 г желатинового порошка к 20 мл PBS (конечные 5% желатина) в центрифужную пробирку объемом 50 мл. После замачивания при температуре RT в течение 15 минут выдерживать при температуре 50 °C на водяной бане в течение 15 минут, не встряхивая.
- Кратковременно перемешайте и инкубируйте при температуре 50 °C еще 15 минут до полного растворения желатина. Оставьте тюбик в режиме RT до использования.
- Усыпить взрослую мышь при вывихе шейки матки.
- Поместите мышь из пункта 2.1.6 на металлический лоток и сделайте небольшой надрез на коже через оболочку хряща с помощью хирургических инструментов.
- Расширьте разрез обеими руками, чтобы обнажить грудную и брюшную области.
- Откройте брюшину, чтобы обнажить диафрагму, а затем откройте диафрагму с обеих сторон.
- Разрежьте грудную клетку по передним подмышечным линиям с обеих сторон, затем удалите грудную стенку, разрезав в поперечном направлении в месте вилочковой железы, чтобы обнажить сердце.
- Сделайте небольшой разрез на ушной раковине правого предсердия для оттока крови и введите крылатую иглу 22-го калибра в верхушку левого желудочка. Нажмите на поршень, чтобы перфузировать ткани 10% буферизованным нейтральным раствором формалина.
- После обнажения органов в малом тазу отрежьте конец прямой кишки от анального отверстия, а кишечник отделите от тела, перерезав брыжейку.
- Чтобы изолировать тощую кишку, разрежьте кишечник на расстоянии 4 см от анальной стороны желудочного антрального отдела. Отбросьте анальную половину оставшейся тонкой кишки.
- Разрежьте тощую кишку пополам, чтобы облегчить процедуру промывки. Загрузите 20 мл 10% буферизованного нейтрального раствора формалина в шприц объемом 20 мл и приложите прямую иглу 18-го калибра, приготовленную на шаге 1.7, к выходному отверстию.
- Введите 10% буферизованный нейтральный раствор формалина с одного конца обрезанной тощей кишки, чтобы вымыть содержимое кишечника и зафиксировать поверхность просвета кишечника (рис. 1A2).
- Промойте просвет кишечника путем введения PBS, как описано в шаге 2.1.15.
- Смойте жидкий желатин в просвет кишечника, как описано в шаге 2.1.15, чтобы заменить PBS жидким желатином.
- Закройте один конец обрезанной тощей кишки путем наложения швов с помощью нейлонового шва 6-0, заполните тощую кишку жидким желатином и закройте противоположный конец с помощью наложения швов (Рисунок 1A3).
- Добавьте четыре шовных узла по размеру сосиски в форме тощей кишки к вдавленной части криомолда (Рисунок 1A4).
заметка: Для криоформ с вдавленным сечением размером 20 мм x 25 мм x 5 мм предпочтительнее сосискообразное сечение тощей кишки ~20 мм.
- Замочите ткани в 50 мл 15% сахарозы в 10% буферизованном растворе нейтрального формалина на ночь при 4 °C.
заметка: Эти этапы обеспечивают криопротекцию сахарозой и фиксацию белка формалином желатина и ткани. Формалин-желатинизированный желатин не плавится при RT, тогда как нефиксированный желатинизированный желатин при 4 °C плавится при RT.
3. Мгновенное замораживание наполненных желатином тканей тощей кишки
- Разрезанием тощей кишки по шовным узлам получают три колбасных кусочка тощей кишки с перевязанными обоими концами (рисунок 1А4). Выровняйте колбасообразные кусочки в криомолде для добавления закладочного состава для приготовления замороженных образцов тканей.
- Мгновенно заморозьте криомолд в изопентане, охлажденном жидким азотом. Хранить криоформы при температуре -80 °C
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
4. Иммунофлуоресценция клеток пучка с использованием свободно плавающих криосекций
- Криосекция
- Установите температуру в криостатной камере (CT) и температуру объекта (OT) на -22 °C. Поместите замороженный тканевый блок в криомолд в криостатную камеру не менее чем на 15 минут.
- Добавьте 3 мл PBS в чашку для культуры диаметром 35 мм.
- Удалите замороженный тканевый блок из криомолда и разрежьте блок пополам лезвием бритвы, чтобы обнажить поперечный срез тощей кишки. Установите одну половину блока на патрон (адаптер для криостата), чтобы разрезать режущую плоскость лезвием бритвы.
- Разделите наполненную желатином тощую кишку на участки толщиной 30 мкм. С помощью замороженных щипцов аккуратно перенесите срезы в чашку для культуры диаметром 35 мм, подготовленную на шаге 4.1.2 (рисунок 2B, справа).
- Применение первичных антител
- Свободно плавающие участки промыть в чашке для культуры диаметром 35 мм 3 раза в течение 5 мин каждый 3 мл PBS-T с легким встряхиванием на возвратно-поступательном шейкере (примерно 36 раз/мин).
- Приготовьте раствор для восстановления антигена: 0,3 мл концентрата раствора для восстановления антигена (Таблица материалов) в 2,7 мл сверхчистой воды. Добавьте 3 мл раствора для извлечения антигена в 35-миллиметровую чашку для культивирования, содержащую свободно плавающие секции.
- Закройте крышку, зазор между чашкой и крышкой заклейте полоской виниловой ленты и выдерживайте при температуре 50 °C в гибридизационном инкубаторе в течение 3 ч без встряхивания.
- Достаньте блюдо из инкубатора и охладите при RT в течение 20 минут. После снятия виниловой ленты промойте срезы 3 раза по 5 мин каждый 3 мл PBS-T и слегка встряхивая.
- Аспирируйте PBS-T и добавьте 5 капель блокирующего раствора (Таблица материалов) на срезы. Инкубировать при RT в течение 5 мин с легким встряхиванием.
- Приготовьте первичный раствор антитела: 495 мкл 5% БСА в PBS с 5 мкл антител фосфо-Y1798 гирдина (pY1798) (Таблица материалов). Добавьте на срезы 500 мкл раствора первичного антитела (блокирующий раствор удалять не нужно).
- Поместите чашку во увлажненную инкубационную камеру и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C с легким встряхиванием.
заметка: Ночная инкубация может быть продлена до трех ночей.
- Применение вторичных антител
- Промойте секции 3 раза по 5 мин каждая в 3 мл PBS-T с легким встряхиванием.
- Приготовьте разбавленный стоковый раствор DAPI: 2 мкл стокового раствора DAPI (Шаг 1,5), 998 мкл PBS.
- Приготовить вторичный раствор антитела: 476 мкл 5% БСА в PBS, 10,5 мкл разбавленного раствора DAPI, 12,5 мкл конъюгата фаллоидина-флуоресцентного красителя, 1 мкл конъюгата IgG-флуоресцентного красителя козы (длина волны: возбуждение 496 нм, излучение 520 нм).
- После аспирации PBS-T внесите вторичный раствор антитела и инкубируйте в инкубационной камере со световым экраном при ЛТ в течение 30 мин с легким встряхиванием.
- Промойте секции 3 раза в течение 5 минут каждая 3 мл PBS-T и слегка встряхните.
- После окончательной промывки извлеките PBS-T и замените его 3 мл PBS, в котором отсутствует октилфениловый эфир полиоксиэтилена(10). Перенесите чашку в стереоскопический микроскоп.
- Поместите 200 мкл PBS в каплю в центр предметного стекла из белого стекла с покрытием MAS и перенесите одну секцию тощей кишки из чашки в каплю с помощью наконечника пипетки P200.
- Отрегулировав выравнивание среза под стереоскопическим микроскопом, аспирируйте все оставшиеся PBS, окружающие срез.
- Добавьте 20 μL водного монтажного материала и поместите покровное стекло размером 20 x 20 мм поверх носителя.
- Немедленно загерметизируйте края покровного стекла монтажным материалом на основе ксилола. Поместите предметное стекло на деревянный картон и дайте монтажному материалу на основе ксилола застыть при RT в течение 2 - 3 ч.
заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь. После того как монтажный материал на основе ксилола затвердеет, предметные стекла можно хранить в течение 2-3 недель в светозащитном слайд-боксе в режиме RT.
5. Конфокальная микроскопия
- Нанесите иммерсионное масло на объектив конфокального микроскопа с 63-кратным увеличением. Поверните покровный слайд вниз и поставьте слайд на сцену.
- Оцифровать изображения TC, полученные на длинах волн лазера 405, 488 и 555 нм, и сохранить изображения в формате tiff (.tiff).
заметка: Выберите набор детектирующих фильтров, подходящий для флуоресцентных красителей (т.е. максимумы возбуждения/излучения: 358/461 нм, 490/525 и 590/617).
