Иммунофлуоресцентный метод визуализации клеток пучка при криорезах тощей кишки

Abstract

Источник: Mizutani, Y. et al., Использование антифосфо-гирдиновых антител для визуализации клеток кишечного пучка в свободно плавающих криорезах тощей кишки мыши.J. Vis. Exp. (2018)

Это видео иллюстрирует основанный на иммунофлуоресценции метод визуализации клеток кишечного пучка в свободно плавающих криосекциях тощей кишки мышей. В пределах кишечных ворсинок ко-локализация зеленой флуоресценции на верхушке просвета с расширенной массой красного корешка указывает на наличие клеток пучка.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка

1. Приготовьте 10 л фосфатно-солевого буфера (PBS): 32,27 г гидрофосфата натрия (Na₂HPO₄·12H₂O), 4,5 г дигидрофосфата натрия (₂PO₄·2H₂O), 80,0 г хлорида натрия (NaCl) добавьте в ультрачистую воду до конечного объема 10 л. Храните раствор при комнатной температуре (RT).
2. Приготовьте 200 мл PBS-T: 200 мл PBS на стадии 1.1 со 100 мкл полиоксиэтилена (10) октилфенилового эфира до конечной концентрации 0,05% (об. об.). Храните в RT.
3. Надев перчатки и защитные очки, приготовьте 50 мл 15% сахарозы в 10% буферизованном растворе нейтрального формалина: 7,5 г сахарозы добавьте к 10% буферизованному раствору нейтрального формалина (Таблица материалов) до конечного объема 50 мл. Магазин по адресу RT.
   осторожность: Вдыхание и/или контакт с формальдегидом на кожу/в глазах в 10% буферизованном нейтральном растворе формалина может быть опасным. Обращайтесь с осторожностью.
4. Приготовьте 1,5 мл 200 ЕД/мл фаллоидин-флуоресцентного конъюгата красителя: фаллоидин-флуоресцентный конъюгат (300 ЕД в 1 флаконе, лиофилизированные твердые вещества, длины волн возбуждения и излучения: 581 нм и 609 нм соответственно) суспендированный в 1,5 мл метанола. Храните раствор в темноте при температуре -20 °C.
5. Приготовьте 5 мг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид (DAPI) стоковый раствор: 10 мг DAPI в 2 мл N, N-диметилформамида (DMF). Храните раствор в темноте при температуре -20 °C.
6. Приготовьте 5% бычий сывороточный альбумин (БСА) в PBS: 0,5 г BSA, 10 мл PBS. Хранить при температуре 4 °C.
7. Снимите скошенный кончик прямой иглы 18-го калибра с помощью кусачки и зажмите зажатый конец щипцем в продольном направлении, чтобы жидкость могла протекать через просвет иглы (рис. 1A1).
   заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь.

2. Вскрытие и выделение тощей кишки у животных

1. Перфузионная фиксация мыши
   1. Надевайте перчатки и работайте в хорошо проветриваемом помещении.
   2. Приготовьте стеклянный стакан объемом 100 мл, 10% буферный раствор нейтрального формалина, хирургические инструменты (ножницы, щипцы), металлический лоток, нейлоновые швы 6-0, прямую иглу 18-го калибра, приготовленную как в 1,7, крылатую иглу 22-го калибра, шприц 20-мл.
   3. Загрузите 20 мл 10% буферизованного нейтрального раствора формалина из стеклянного стакана в шприц объемом 20 мл и прикрепите крылышко 22-го калибра к выпускному отверстию.
   4. Приготовьте жидкий желатин, добавив 1 г желатинового порошка к 20 мл PBS (конечные 5% желатина) в центрифужную пробирку объемом 50 мл. После замачивания при температуре RT в течение 15 минут выдерживать при температуре 50 °C на водяной бане в течение 15 минут, не встряхивая.
   5. Кратковременно перемешайте и инкубируйте при температуре 50 °C еще 15 минут до полного растворения желатина. Оставьте тюбик в режиме RT до использования.
   6. Усыпить взрослую мышь при вывихе шейки матки.
   7. Поместите мышь из пункта 2.1.6 на металлический лоток и сделайте небольшой надрез на коже через оболочку хряща с помощью хирургических инструментов.
   8. Расширьте разрез обеими руками, чтобы обнажить грудную и брюшную области.
   9. Откройте брюшину, чтобы обнажить диафрагму, а затем откройте диафрагму с обеих сторон.
   10. Разрежьте грудную клетку по передним подмышечным линиям с обеих сторон, затем удалите грудную стенку, разрезав в поперечном направлении в месте вилочковой железы, чтобы обнажить сердце.
   11. Сделайте небольшой разрез на ушной раковине правого предсердия для оттока крови и введите крылатую иглу 22-го калибра в верхушку левого желудочка. Нажмите на поршень, чтобы перфузировать ткани 10% буферизованным нейтральным раствором формалина.
   12. После обнажения органов в малом тазу отрежьте конец прямой кишки от анального отверстия, а кишечник отделите от тела, перерезав брыжейку.
   13. Чтобы изолировать тощую кишку, разрежьте кишечник на расстоянии 4 см от анальной стороны желудочного антрального отдела. Отбросьте анальную половину оставшейся тонкой кишки.
   14. Разрежьте тощую кишку пополам, чтобы облегчить процедуру промывки. Загрузите 20 мл 10% буферизованного нейтрального раствора формалина в шприц объемом 20 мл и приложите прямую иглу 18-го калибра, приготовленную на шаге 1.7, к выходному отверстию.
   15. Введите 10% буферизованный нейтральный раствор формалина с одного конца обрезанной тощей кишки, чтобы вымыть содержимое кишечника и зафиксировать поверхность просвета кишечника (рис. 1A2).
   16. Промойте просвет кишечника путем введения PBS, как описано в шаге 2.1.15.
   17. Смойте жидкий желатин в просвет кишечника, как описано в шаге 2.1.15, чтобы заменить PBS жидким желатином.
   18. Закройте один конец обрезанной тощей кишки путем наложения швов с помощью нейлонового шва 6-0, заполните тощую кишку жидким желатином и закройте противоположный конец с помощью наложения швов (Рисунок 1A3).
   19. Добавьте четыре шовных узла по размеру сосиски в форме тощей кишки к вдавленной части криомолда (Рисунок 1A4).
       заметка: Для криоформ с вдавленным сечением размером 20 мм x 25 мм x 5 мм предпочтительнее сосискообразное сечение тощей кишки ~20 мм.
   20. Замочите ткани в 50 мл 15% сахарозы в 10% буферизованном растворе нейтрального формалина на ночь при 4 °C.
       заметка: Эти этапы обеспечивают криопротекцию сахарозой и фиксацию белка формалином желатина и ткани. Формалин-желатинизированный желатин не плавится при RT, тогда как нефиксированный желатинизированный желатин при 4 °C плавится при RT.

3. Мгновенное замораживание наполненных желатином тканей тощей кишки

1. Разрезанием тощей кишки по шовным узлам получают три колбасных кусочка тощей кишки с перевязанными обоими концами (рисунок 1А4). Выровняйте колбасообразные кусочки в криомолде для добавления закладочного состава для приготовления замороженных образцов тканей.
2. Мгновенно заморозьте криомолд в изопентане, охлажденном жидким азотом. Хранить криоформы при температуре -80 °C
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.

4. Иммунофлуоресценция клеток пучка с использованием свободно плавающих криосекций

1. Криосекция
   1. Установите температуру в криостатной камере (CT) и температуру объекта (OT) на -22 °C. Поместите замороженный тканевый блок в криомолд в криостатную камеру не менее чем на 15 минут.
   2. Добавьте 3 мл PBS в чашку для культуры диаметром 35 мм.
   3. Удалите замороженный тканевый блок из криомолда и разрежьте блок пополам лезвием бритвы, чтобы обнажить поперечный срез тощей кишки. Установите одну половину блока на патрон (адаптер для криостата), чтобы разрезать режущую плоскость лезвием бритвы.
   4. Разделите наполненную желатином тощую кишку на участки толщиной 30 мкм. С помощью замороженных щипцов аккуратно перенесите срезы в чашку для культуры диаметром 35 мм, подготовленную на шаге 4.1.2 (рисунок 2B, справа).
2. Применение первичных антител
   1. Свободно плавающие участки промыть в чашке для культуры диаметром 35 мм 3 раза в течение 5 мин каждый 3 мл PBS-T с легким встряхиванием на возвратно-поступательном шейкере (примерно 36 раз/мин).
   2. Приготовьте раствор для восстановления антигена: 0,3 мл концентрата раствора для восстановления антигена (Таблица материалов) в 2,7 мл сверхчистой воды. Добавьте 3 мл раствора для извлечения антигена в 35-миллиметровую чашку для культивирования, содержащую свободно плавающие секции.
   3. Закройте крышку, зазор между чашкой и крышкой заклейте полоской виниловой ленты и выдерживайте при температуре 50 °C в гибридизационном инкубаторе в течение 3 ч без встряхивания.
   4. Достаньте блюдо из инкубатора и охладите при RT в течение 20 минут. После снятия виниловой ленты промойте срезы 3 раза по 5 мин каждый 3 мл PBS-T и слегка встряхивая.
   5. Аспирируйте PBS-T и добавьте 5 капель блокирующего раствора (Таблица материалов) на срезы. Инкубировать при RT в течение 5 мин с легким встряхиванием.
   6. Приготовьте первичный раствор антитела: 495 мкл 5% БСА в PBS с 5 мкл антител фосфо-Y1798 гирдина (pY1798) (Таблица материалов). Добавьте на срезы 500 мкл раствора первичного антитела (блокирующий раствор удалять не нужно).
   7. Поместите чашку во увлажненную инкубационную камеру и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C с легким встряхиванием.
      заметка: Ночная инкубация может быть продлена до трех ночей.
3. Применение вторичных антител
   1. Промойте секции 3 раза по 5 мин каждая в 3 мл PBS-T с легким встряхиванием.
   2. Приготовьте разбавленный стоковый раствор DAPI: 2 мкл стокового раствора DAPI (Шаг 1,5), 998 мкл PBS.
   3. Приготовить вторичный раствор антитела: 476 мкл 5% БСА в PBS, 10,5 мкл разбавленного раствора DAPI, 12,5 мкл конъюгата фаллоидина-флуоресцентного красителя, 1 мкл конъюгата IgG-флуоресцентного красителя козы (длина волны: возбуждение 496 нм, излучение 520 нм).
   4. После аспирации PBS-T внесите вторичный раствор антитела и инкубируйте в инкубационной камере со световым экраном при ЛТ в течение 30 мин с легким встряхиванием.
   5. Промойте секции 3 раза в течение 5 минут каждая 3 мл PBS-T и слегка встряхните.
   6. После окончательной промывки извлеките PBS-T и замените его 3 мл PBS, в котором отсутствует октилфениловый эфир полиоксиэтилена(10). Перенесите чашку в стереоскопический микроскоп.
   7. Поместите 200 мкл PBS в каплю в центр предметного стекла из белого стекла с покрытием MAS и перенесите одну секцию тощей кишки из чашки в каплю с помощью наконечника пипетки P200.
   8. Отрегулировав выравнивание среза под стереоскопическим микроскопом, аспирируйте все оставшиеся PBS, окружающие срез.
   9. Добавьте 20 μL водного монтажного материала и поместите покровное стекло размером 20 x 20 мм поверх носителя.
   10. Немедленно загерметизируйте края покровного стекла монтажным материалом на основе ксилола. Поместите предметное стекло на деревянный картон и дайте монтажному материалу на основе ксилола застыть при RT в течение 2 - 3 ч.
       заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь. После того как монтажный материал на основе ксилола затвердеет, предметные стекла можно хранить в течение 2-3 недель в светозащитном слайд-боксе в режиме RT.

5. Конфокальная микроскопия

1. Нанесите иммерсионное масло на объектив конфокального микроскопа с 63-кратным увеличением. Поверните покровный слайд вниз и поставьте слайд на сцену.
2. Оцифровать изображения TC, полученные на длинах волн лазера 405, 488 и 555 нм, и сохранить изображения в формате tiff (.tiff).
   заметка: Выберите набор детектирующих фильтров, подходящий для флуоресцентных красителей (т.е. максимумы возбуждения/излучения: 358/461 нм, 490/525 и 590/617).

Results

Рисунок 1: Желатиновое заполнение срезов тощей кишки для морфологической сохранности криорезов
(A) Фотографии процедур внутрипросветного заполнения тощей кишки мыши желатином. (A1) Скошенный кончик прямой иглы 18-го калибра был удален, чтобы избежать прокола стенки кишечника. (A2) Буферизированный нейтральный раствор формалина (10%) вводили в од...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slc:DDY 6-недельные самки мышей	Тюбу Кагаку Сидзай	Не применимо
Динатрия гидрогенфосфат 12-водный (Na2HPO412H2O)	Вако	196-02835 (Английский
Дигидрат дигидроенфосфата натрия (NaH2PO42H2O	Вако	199-02825 (Английский)
Хлорид натрия (NaCl)	Вако	199-10665
Triton X-100, октилфениловый эфир полиоксиэтилен(10)	Катаяма Кемикал	Не применимо
сахароза	Вако	190-00013 (Английский)
10% буферизованный нейтральный раствор формалина	Муто Кемикал	20215	Шаг 1.3.
Фаллоидин-флуоресцентный конъюгат красителя, фаллоидин Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	А12381
метанол	Накалай Теске	21915-35
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид)	ThermoFisher Scientific	Д1306
N.N-диметилформамид (ДМФА)	Накалай Теске	13015-75
Бычий сывороточный альбумин	сигма	А9647-10Г
Прямая игла из нержавеющей стали 18 калибра	Терумо	НН-1838Р
U.S.P. 6-0, нейлоновый шовный материал 60 см, Crownjun	Коно Сэйсакусё	Не применимо
Крылатая игла 22 калибра	Терумо	СВ-22ДЛК
Шприц TERUMO 20 мл	Терумо	СС-20ЧС
Центрифужная пробирка объемом 50 мл	ТЭС	91050
15 мл центрифужные пробирки Iwaki	Иваки	2325-015
Микропробирка 1,5 мл	звезда	РСВ-МТТ1.5
Желатиновый порошок, Gelare-blanc	Нитта Биолаб	2809
Закладочный компаунд для замороженных образцов тканей, O.C.T. Compound 118 мл 12 шт.	Сакура ФайнТех	4583
Криоформа, CRYO DISH No3, 125 шт., размер лунки 20 x 25 x 5 (мм)	Shoei Work's	1101-3
Изопентан	Накалай Теске	26404-75
Чашка для клеточных культур сокола 35 x 10 мм Easy-Grip	Корнинг	353001
Концентрат раствора для извлечения антигена, Target Retrieval раствор pH 9 10x	Дако	С2367	Концентрат раствора для извлечения антигена на шаге 4.2.2.
Белковый блок	Дако	Х0909	Решение по блокировке в версии 4.2.5.
Антитела к гирдину фосфо-Y1798 (pY1798)	Иммунобиологические лаборатории (IBL) = Компания X	No 28143	Антитела к гирдину Phospho-Y1798 на этапе 4.2.6.
Козье антитело против кролика IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	А11034
Водный монтажный материал, Prolong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	П36930
Покровные стекла, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 мм 100 шт. Толщина No1	Стекло Мацунами	C022221
Entellan Новый монтажный носитель на основе ксилола для микроскопии	Мерк Миллипор	107961
Стекло с покрытием MAS белого цвета	Стекло Мацунами	МИ-МАС-01
Деревянный маппе типа КО	Shoei Work's	99-40007
Погружное масло 518 F Флуоресцентное 20 мл	Цейсс	No 444960 (Английский
Пипетки, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)	Гилсон	F144801, F123600, F123601, F123602
Система производства сверхчистой воды	Адвантек	ГС-590
Пластиковая перчатка, Звездчатая нитриловая перчатка	звезда	RSU-NGVM
криостат	Leica Microsystems	КМ1950
Морозильная камера, SANYO Ultra Low	Саньо	МДФ-382
Витринный холодильник	Морозильная камера Nihon	НК-МЭ50ЕС
Водяная баня, Thermominder SDminiN (для растворения желатина при 50 С)	Тайтек	0068750-000
Гибридизационный инкубатор (для забора антигена при 50 С)	Тайтек	НВ-100
Инкубационная камера для иммуноокрашивания	Космо Био	10DO
Взаимный шейкер для иммуногистохимии (при комнатной температуре)	Тайтек	НР-1
Взаимный шейкер для иммуногистохимии (для 4 С)	Токио Рика Кикай	ММС-3010
Стереоскопический микроскоп (для работы с тканями)	Олимп	СЗ61
Стереоскопический микроскоп (для рисунка 1B)	Leica Microsystems	М165ФК
Флуоресцентный микроскоп (для рис. 3)	Компания Nikon	Е800
Конфокальный лазерно-сканирующий микроскоп	Цейсс	ЛСМ700