Метод in vivo для отслеживания индуцированного биспецифическими антителами транспорта Т-клеток в опухоли

Аннотация

Источник: Espinosa-Cotton, M., et al. Отслеживание трафика Т-клеток, индуцированных биспецифическими антителами, с использованием трансдуцированных люциферазой Т-клеток человека. J. Vis. Exp. (2023).

Это видео демонстрирует метод отслеживания индуцированного биспецифическими антителами переноса Т-клеток в опухоли в мышиной модели. Трансдуцированные люциферазой эффекторные Т-клетки вводят мышке с помощью ксенотрансплантата подкожных опухолевых клеток. Затем вводятся биспецифические антитела, связывающиеся с Т-клетками и опухолевыми клетками. Локализация Т-клеток отслеживается с помощью биолюминесцентной визуализации, при этом величина сигнала указывает на степень инфильтрации Т-клеток в опухоль.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Трансфекция клеток 293T люциферазой и сбор вирусного надосадочной

жидкости

1. Культивирование клеток 293T
   1. Приготовьте среду, добавив в литр модифицированной среды Dulbecco Eagle (DMEM) следующее: 110 мл термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 11 мл пенициллин-стрептомицина.
   2. Разморозьте 5 x 10⁶ элементов 293T и перенесите их в колбу T175 с подготовленной средой, как описано выше.
   3. Разделяйте ячейки 293T в соотношении 1:10 каждые 3 дня в течение 6 дней. Не допускайте, чтобы клетки сливались более чем на 90%.
2. Трансфекция клеток 293T
   заметка: Следующие количества реагентов рассчитаны для трансфекции одной колбы T175 с 293Т-клетками. Отрегулируйте соответствующим образом, если необходимо трансдуцировать больше колб.
   1. Перенесите по 1,5 мл среды в каждую из двух пробирок объемом 50 мл с помощью пипетки. В одну пробирку добавьте 10 г плазмиды VSV-G, 20 г Gag/pol и 20 г плазмиды люциферазы и перемешайте. В другую пробирку добавьте 100 мкл реагента для трансфекции ДНК in vitro и перемешайте. Инкубируйте обе пробирки при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.<бр/> заметка: Все плазмиды, описанные в этой рукописи, были предоставлены доктором Владимиром Пономаревым.
   2. Перенесите среду, содержащую реагент для трансфекции ДНК in vitro, по каплям в пробирку, содержащую ДНК-плазмиды (в течение примерно 30 с), и аккуратно перемешайте пипеткой. Инкубировать при RT в течение 20 минут.
   3. Во время этой 20-минутной инкубации отделите клетки 293T, добавив 5-10 мл 0,05% трипсина. После того, как ячейки отделятся, добавьте 10 мл среды и центрифугируйте при 800 x g в течение 5 минут. Ресуспендируйте клетки в 1,5 мл среды.
   4. Добавьте среды, содержащие реагент для трансфекции ДНК in vitro и плазмиды ДНК, к клеткам 293T и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
   5. Переложите в колбу T175 и добавьте 18 мл среды. Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи.
   6. На следующий день осторожно отсасывайте среду стеклянной пипеткой, не отделяя клетки. Замените на 18 мл свежей среды. Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи в инкубаторе.
3. Заготовка вирусного надосадочной жидкости
   1. Удалите вирусную надосадочную жидкость с помощью пипетки, положенной на лед. Центрифуга при давлении 800 x g в течение 5 минут для гранулирования клеток и мусора.
      заметка: Если клеточная гранула большая, клетки, вероятно, были разрушены из колбы при удалении надосадочной жидкости. Эти ячейки можно снова поместить в новую колбу со свежей средой.
   2. Отфильтруйте вирусную надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,22 мкм.
   3. Немедленно используйте вирусную надосадочную жидкость. Храните его на льду или при температуре 4 °C до 24 часов или замораживайте при температуре -80 °C для длительного хранения.

2. Экспансия и трансдукция активированных Т-клеток человека люциферазой

1. Активация Т-клеток человека in vitro
   1. Промойте шарики, добавив 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), в стерильную пробирку объемом 15 мл, добавив шарики (одна бусина на две Т-клетки), поместив в магнитный штатив на 2 минуты и отсосав PBS.
   2. Приготовьте среду, как описано в шаге 1.1.1, затем добавьте IL-2 до конечной концентрации 30 МЕ/мл и добавьте промытые шарики. Вносите 2,5 мл среды на каждые два миллиона активированных Т-клеток.
   3. Подсчитайте количество Т-клеток (свежеочищенных или ранее очищенных, замороженных, размороженных и промытых) с помощью гемоцитометра и трипанового синего красителя. Добавьте Т-клетки в среду, приготовленную на шаге 2.1.2, и аккуратно переверните пробирку для перемешивания. Т-клетки будут увеличиваться по крайней мере в 20 раз в зависимости от источника и общего состояния клеток. Определите количество Т-клеток для активации, рассчитав количество, необходимое для лечения мышей, и разделив на 20. Здесь на основе предварительных экспериментов было использовано 20 x 10⁶ Т-клеток на мышь.
   4. Планшет 2,5 мл среды, содержащей два миллиона Т-клеток, гранул и (интерлейкина 2) IL-2 в каждой лунке 24-луночного планшета для культуры тканей. Культивирование при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% содержанием_CO2.
   5. Исследуйте Т-клетки под 20-кратным микроскопом каждый день в течение следующих 3 дней, чтобы определить, когда следует проводить трансдукцию люциферазой. Клетки готовы, когда они слипаются и истощают среду, превращая ее из красной/розовой в светло-оранжевую.
2. Приготовление ретронектиновых пластин
   заметка: Ретронектин используется для покрытия пластин, используемых при трансдукции, поскольку он усиливает трансдукцию генов.
   1. Добавьте 2 мл 20 мкг/мл ретронектина в PBS в лунку необработанного 6-луночного планшета. Инкубировать в течение 2 ч при RT или 1 ч при 37 °C. Для каждых двух миллионов Т-клеток, которые должны быть трансдуцированы, требуется одна лунка, покрытая ретронектином.
   2. Аспирируйте ретронектин, не царапая дно пластины.
   3. Добавьте 3 мл 2% BSA в PBS (стерильный фильтрованный) на лунку в 6-луночном планшете. Инкубировать в течение 30 минут при RT.
3. Спинокуляция
   1. Отсасывайте БСА, не царапая дно пластины.
   2. Промойте лунки один раз 3 мл PBS на лунку. Продолжайте или замените на свежий PBS и оставьте тарелку под крышкой при температуре 4 °C на ночь.
   3. Добавьте 2 мл вирусного супернатанта люциферазы CBR-TDR (собрано на шаге 1.3) на лунку.
   4. Центрифуга при давлении 1 240 x g в течение 90 мин при 32 °C.
4. трансдукция
   1. Подсчитайте количество Т-клеток.
   2. Аспирируйте вирусную надосадочную жидкость, не царапая дно пластины.
   3. Поместите два миллиона Т-клеток в лунку в 6 мл DMEM, содержащего 30 МЕ/мл человеческого IL-2.
   4. Ежедневно исследуйте Т-клетки. Т-клетки готовы к расширению, когда они почти сливаются, обычно через 2 дня.
   5. Когда ячейки почти сольются, аккуратно смойте их с нижней части планшета с помощью пипетки и переложите каждую лунку в отдельную колбу T75. Добавьте 9 мл среды, чтобы получить в общей сложности 15 мл среды на колбу.
   6. На следующий день добавьте еще 15 мл среды. Клетки должны быть готовы к введению мышам на следующий день после такого добавления среды. Подтвердите успешную трансдукцию с помощью проточной цитометрии (конструкция люциферазы содержит TD-флуорофор томата, который виден в ТЭЛА-канале).

3. Приживление Т-клеток, трансдуцированных люциферазой, у мышей с ослабленным иммунитетом

1. Подготовьте и подсчитайте количество Т-клеток для инъекций.
   1. Извлеките Т-клетки из колб и посчитайте. Клетки готовы к инъекции, когда они расширяются в 20-30 раз, обычно на 7-й день после активации.
   2. Центрифугируйте Т-клетки при давлении 800 x g в течение 5 мин. Повторно суспендируйте в 2 мл среды и удалите шарики с помощью магнитного штатива.
   3. В экспериментах, в которых Т-клетки будут вводиться отдельно от биспецифических антител, подсчитывают количество Т-клеток и ресуспендируют так, чтобы конечная концентрация составляла 20 миллионов Т-клеток на 100 μл среды. Перейдите к шагу 3.2. Для экспериментов с использованием Т-клеток, вооруженных ex vivo (EATs), перейдите к шагу 3.1.4.
   4. Для экспериментов с использованием Т-клеток, вооруженных ex vivo, подсчитайте Т-клетки и разделите их на отдельные пробирки объемом 1,5 мл для каждой группы, по 20 миллионов клеток на мышь. Например, если есть три группы по пять мышей в каждой, приготовьте три пробирки объемом 1,5 мл со 100 миллионами Т-клеток каждая.
   5. Центрифугируйте пробирки объемом 1,5 мл при давлении 800 x g в течение 5 мин. Осторожно удалите среду, не повреждая Т-клеточную гранулу. Ресуспендируйте в не более чем 50 мкл среды, содержащей биспецифические антитела. Инкубировать при RT в течение 30 мин.<бр/> заметка: Для целей экспериментов, проведенных в этом исследовании, были использованы запатентованные биспецифические антитела IgG-[L]-scFv T-клетки, полученные в лаборатории. Для армирования Т-клеток используйте 5 г антител на 20 x 10⁶ Т-клеток. Также можно использовать коммерчески доступные биспецифические антитела.
   6. Смойте избыток антител, добавив 1 450 мкл среды в каждую пробирку. Центрифугируйте при давлении 800 x g в течение 5 минут, тщательно отсасывайте среду и повторно суспендируйте в концентрации 20 миллионов вооруженных Т-клеток на 100 μл среды.
2. Инъекция и приживление мышам
   1. Обезболивайте мышей в камере, поставляющей 3,5% (v/v) ингаляционного изофлурана в 1 л/мин кислорода. Мыши полностью обезболиваются, когда рефлекс отвода педали задней конечности исчезает.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте тепловую поддержку на протяжении всей процедуры.
   2. С помощью иглы 26 G введите 20 миллионов Т-клеток в 100 μл среды ретроорбитально на каждую мышь.
   3. Введение 1000 U рекомбинантного IL-2 подкожно для поддержания выживаемости Т-клеток in vivo.
   4. Вводите биспецифические антитела ретроорбитально (в глаз, не используемый для инъекции Т-клеток) или внутрибрюшинно. Дайте мышам оправиться от анестезии и вернуться в свои клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, здесь использовались запатентованные антитела, которые были получены в лаборатории, но вместо них можно было использовать коммерчески доступные антитела. В приведенных здесь экспериментах вводили 0,3-10 мкг антител на мышь на дозу. Антитела вводили два раза в неделю в течение 3-4 недель.

4. Визуализация in vivo мышей, привитых люциферазо-трансдуцированными Т-клетками

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен в день визуализации, который не обязательно совпадает с днем, когда мышам вводят Т-клетки и/или антитела. Как правило, визуализацию проводят через 24 часа после введения люциферазо-трансдуцированных Т-клеток.

1. Приготовление D-люциферина
   1. Растворите 1 г D-люциферина в 33,3 мл стерильного PBS (конечная концентрация: 30 мг/мл).
   2. Распределите растворенный D-люциферин в 33 микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл и поддерживайте температуру в пробирках при температуре -20 °C.
   3. В день визуализации разморозьте аликвоты 30 мг/мл D-люциферина, чтобы количество животных было визуализировано. Одной трубки хватит на 10 животных.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Повторно заморозьте оставшийся D-люциферин после использования. D-люциферин стабилен в течение как минимум пяти циклов замораживания/размораживания.
2. Введение D-люциферина мышам
   заметка: Перед введением D-люциферина мышам откройте программное обеспечение для визуализации и инициализируйте систему. Для охлаждения камеры может потребоваться несколько минут, и это следует сделать до того, как мышам будет введен D-люциферин, чтобы гарантировать, что визуализация может произойти через 5 минут после введения субстрата.
   1. Обезболите до пяти мышей в камере, поставляющей 3,5% (v/v) ингаляционного изофлурана в 1 л/мин кислорода. Мыши полностью обезболиваются, когда рефлекс отвода педали задней конечности исчезает
   .
   2. После того, как мыши будут полностью обезболены, введите 100 мкл 30 мг/мл D-люциферина на мышь (3 мг на мышь) путем ретроорбитальной инъекции с помощью иглы 26 G. Представьте себе эту группу мышей перед введением D-люциферина следующей группе. Поместите следующую группу мышей в камеру с изофлураном для анестезии, пока проводится визуализация предыдущей группы.
3. Визуализация Т-клеток, трансдуцированных люциферазой
   1. Переместите мышей под наркозом в светонепроницаемую камеру тепловизора и продолжайте вводить 3% изофлуран со скоростью 0,5 л/мин. Положите мышей на бок так, чтобы бок, несущий ксенотрансплантат, был обращен вверх к камере. Сделайте еще одну серию снимков с мышами в положении лежа на спине, чтобы оценить присутствие Т-клеток в легких.
   2. С помощью панели управления «Захват» выберите «Люминесцентный», «Фотографический» и «Наложение». Установите время экспозиции на авто, биннинг на средний и F/Stop на 1. Получение изображений. После первого изображения установите время экспозиции в соответствии с тем, которое было автоматически рассчитано для первого изображения, чтобы можно было напрямую сравнивать последующие изображения. Может быть полезно делать снимки с несколькими временами экспозиции, чтобы определить оптимальное время экспозиции для достижения самого яркого сигнала без насыщения пикселей.
   3. Удалите мышей из изофлурана, вернитесь в клетки и наблюдайте до тех пор, пока они не придут в себя и не начнут передвигаться.
   4. Повторяйте шаги, начиная с шага 4.2.1, пока не будут созданы изображения всех групп.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Элементы 293T	АТКС	ЦРЛ-11268
БСА	Сигма Олдрич	А7030-10Г
Бусины CD3/CD28	Gibco (ThermoFisher)	11161Д
D-люциферин, калийная соль	Голдбио	ЛАК-1Г
DMEM	Gibco (ThermoFisher)	11965092
Реагент для трансфекции ДНК in vitro (полиджет)	Лаборатории SignaGen	SL100688
Эдта	Сигма Олдрич	Е9884-100Г
ФБС	Gibco (ThermoFisher)	10437028
Плазмида Gag/pol	Адджен	14887
Плазмида GFP	Адджен	11150-DNA.cg
Пеницилин-стрептомицин	Gibco (ThermoFisher)	15140122
Рекомбинантный человеческий IL-2	Системы НИОКР	202-ИЛ-010/КФ
Ретронектин	Такара	Т100Б
трипсин	Gibco (ThermoFisher)	Телефон: 25-300-120
Плазмида VSV-G	Адджен	8454