Метод иммунофлуоресценции с двойным мечением для визуализации белков хозяина и патогена в инфицированной клетке

Аннотация

Источник: Gachet-Castro, C. et al., Двойная маркировка иммунофлуоресценции с использованием антител из одного и того же вида для изучения взаимодействий хозяина-патогена.J. Vis. Exp.(2021)

Это видео демонстрирует двойную маркировку иммуноокрашивания двумя разными первичными антителами, выращенными у одного и того же вида, связывающимися специфически с белками паразита и хозяина. Кроме того, меченые вторичные антитела, нацеленные на эти первичные антитела, позволяют отчетливо визуализировать белки хозяина и паразита, облегчая изучение взаимодействия хозяина и патогена.

Протокол

1. Клеточные и паразитарные культуры

1. Выращивайте клетки LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) из Американской коллекции типовых культур (CCL-7) в колбе 2-х клеточной культуры размером 25 см^, содержащей среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с добавлением 10% инактивированной при нагревании FBS (фетальной сыворотки крупного рогатого скота) и антибиотиков (100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при 37 °C в 5% углекислом газе (CO₂).
2. Инфицировать клетки LLC-MK2 штаммом Trypanosoma cruzi (штамм Y) в соответствии с предыдущим протоколом.
3. Соберите надосадочную жидкость инфицированных клеток LLC-MK2 (5 мл) в коническую центрифужную пробирку для клеточных культур объемом 15 мл и центрифугируйте при 500 x g в течение 10 минут и 22 °C для снижения клеточного мусора. Держите трубку в течение 10 минут при температуре 37 °C, чтобы трипомастиготы могли подплыть к надосадочной жидкости.
4. Соберите надосадочную жидкость в новую коническую пробирку и центрифугируйте при 2500 x g в течение 15 минут при 22 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу, содержащую паразитов, в полной среде RPMI для определения плотности клеток путем подсчета клеток в камере Нейбауэра.

2. Протокол контроля иммунофлуоресценции

ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации пластины, содержащие покровные стекла, можно хранить при температуре 4 °C в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) (pH 7,2) в течение одной недели. Для хранения важно, чтобы клетки не прошли этап проникновения.

1. Отсадите ячейки ООО-МК2 (2 x 10⁴) в 24-луночные планшеты, содержащие ультрафиолетовые (УФ) стерилизованные округлые покровные стекла в среде RPMI в течение 16 часов.
2. Для инфицированных клеток добавьте надосадочную жидкость, содержащую T. cruzi (поз. 1.4), в каждую лунку в пропорции (кратность инфекции, MOI 10:1) и оставьте на 6 ч после заражения. Покровные листы, содержащие инфицированные и неинфицированные клетки, пять раз промыть раствором PBS и зафиксированными 2% параформальдегидом в 1x PBS (pH 7,2) в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
3. Промойте покровные стекла три раза по 5 минут каждый с 1x PBS (pH 7,2).
4. Пропитайте покровные стекла 0,2% IGEPAL CA-630 (октилфеноксиполиэтоксиэтанол) в 1x PBS (PH 7,2) в течение 10 минут на RT.
5. Промойте покровные стекла три раза по 5 минут каждый с 1x PBS.
6. Инкубировать покровные стекла в течение 30 минут при РТ с блокирующим раствором (2% бычьего сывороточного альбумина, BSA в 1x PBS, pH 7,2).
7. Инкубируйте покровные листы в течение 30 мин в РТ либо с мышиным моноклональным анти-hnRNPA1 (антигетерогенный рибонуклеопротеин-А1) (разведение 1:200), либо с мышиными поликлональными анти-TcFAZ (белком зоны прикрепления жгутика против Trypanosoma cruzi) (разведение 1:100), разведенными в блокирующем растворе.
8. Промойте покровные стекла три раза по 5 минут каждый с 1x PBS.
9. Инкубируйте покровные стекла в течение 30 мин при РТ с козьим антимышиным IgG F (ab')2 (H+L), конъюгированным с Alexa Fluor 488 (1:600), вместе с фаллоидином, конъюгированным с Alexa 594 (1:300), для окрашивания актиновых филаментов (F-актина) в клетке-хозяине, разведенных в блокирующем растворе.
10. Трижды промыть 1x PBS (pH 7,2) в течение 5 минут каждый.
11. Нанесите небольшое количество монтажного реагента ProLong Gold с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) на поверхность предметного стекла.
12. С помощью щипцов аккуратно наклоните покровное стекло в монтажной среде, чтобы предотвратить образование пузырьков. После высыхания при желании закройте покровное стекло.

3. Протокол иммунофлуоресценции с двойной мечкой с использованием моноклональных и поликлональных антител, выращенных в одном и том же хозяине

1. Повторите шаги с 2.1 по 2.6, описанные выше.
2. Инкубировать покровные листы, содержащие инфицированные и неинфицированные клетки, с поликлональными антителами к TcFAZ (1:100) мыши, разведенными в блокирующем растворе в течение 30 мин при ЛТ.
3. Промойте покровные стекла три раза по 5 минут каждый с 1x PBS.
4. Инкубируйте покровные стекла в течение 30 минут при РТ с козьим антимышиным IgG F (ab')2 (H+L), конъюгированным с Alexa Fluor 647 (1:600), разведенным в блокирующем растворе.
5. Промойте покровные стекла три раза по 5 минут каждый с 1x PBS.
6. Второй этап блокировки проведите с помощью антимышиного IgG (H+L) AffiniPure, разведенного (0,12 мг/мл) в растворе блокирующей жидкости в течение 30 минут при РТ.
7. Промойте покровные стекла три раза с 1x PBS (pH 7,2) в течение 5 минут каждый. Затем инкубируют с мышиным моноклональным антителом к hnRNP A1 IgG2b (1:200) в течение 30 минут при ЛТ.
8. Промойте покровные стекла три раза по 5 минут каждый с 1x PBS.
9. Инкубируйте покровные стекла в течение 30 минут с антителом козы против мыши IgG2b, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (1:600) и фаллоидином, конъюгированным с Alexa 594 (1:300), разведенным в блокирующем растворе.
10. Промойте покровные стекла три раза по 5 минут каждый с 1x PBS.
11. Повторите шаги с 2.8 по 2.10, описанные выше.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Alexa Fluor 488 - антитела IgG2b	Life technologies, США	А21141	Козий антимышь
AffiniPure Rabbit против мышей IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, США	315-005-003	Антитела к мышам
Alexa Fluor 488 - антитела IgG F(ab')2 (H+L)	Life technologies, США	А11017	Козий антимышь
Антитела Alexa Fluor 594 IgG1	Life technologies, США	А21125	Козий антимышь
Alexa Fluor 647 - антитела IgG F(ab')2 (H+L)	Life technologies, США	А21237	Козий антимышь
Антитело IgG2b к hnRNPA1	Сигма-Олдрич, США	Р4528	Антитела мыши
антитела против TcFAZ (белок T. cruzi FAZ)	Наша лаборатория	Внутри компании	Антитела мыши
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Сигма-Олдрич, США	А2153-10Г	Белок альбумин
Моющее средство Igepal CA-630	Сигма-Олдрич, США	И3021	Неионогенное моющее средство
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco, Thermo fisher scientific, США	12657-029 (Английский)	сыворотка
Пенициллин стрептомицин	Gibco, Thermo fisher scientific, США	15140-122	антибиотик
Фаллоидин Alexa Fluor 594	Life technologies, США	А12381	Маркер Актин
Антифейд ProLong Gold с DAPI	Life technologies, США	П36935	Реагент для монтажных сред
RPMI 1640 1X с L-глютамином	Corning, США	10-040-CV	Среды для клеточных культур
Раствор трипсин-ЭДТА	Сигма-Олдрич, США	Т4049-100МЛ	Биореагент