$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Очистка антител с помощью аффинной хроматографии с использованием автоматизированной системы быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC)
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура в общем случае может быть применена к большинству автоматизированных систем. Очистка может производиться при комнатной температуре или при 4 °C (если система FPLC хранится в прохладном помещении). Для определения оптимальных условий очистки, включая соответствующую матрицу колонок, связывающий буфер, буфер для элюирования и рН, можно провести серию скаутских тестов для обеспечения максимального восстановления очищенных антител из кондиционированных сред (см. раздел «Результаты»). Оптимальные условия зависят от очищаемого антитела или белка. Очистки проводились на автоматизированной системе FPLC. Очищение проводили при комнатной температуре с использованием колонки с белком А объемом 5 мл.
- Приготовьте следующие буферы с использованием сверхчистой воды и отрегулируйте до рекомендуемого pH, а затем отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм.
- Приготовьте 1 л фосфатно-солевого буфера (PBS) pH 7,4 (связывающий буфер), смешав следующие вещества: 0,14 М NaCl, 0,0027 М KCl, 0,01 М Na2HPO4 и 0,001 М KH2PO4. При необходимости отрегулируйте pH перед фильтрацией буфера.
- Приготовьте 500 мл 0,1 М глицин-HCl pH 2,7 (элюирующий буфер). Отрегулируйте pH перед фильтрацией буфера.
- Приготовьте 50 мл 1 М Трис pH 9,0 (нейтрализующий буфер).
- Убедитесь, что все соединения системы питания и связи с компьютером выполнены. Устройства должны быть видны в программном модуле «Управление системой». Убедитесь, что УФ-элемент настроен на длину волны 280 нм. Дополнительно: Откалибруйте pH-метр, если он подключен и будет использоваться.
- Погрузите входные трубки A, B и насос для отбора проб в сверхчистую воду для промывки системы. Продуйте насосы шприцем, если в трубке есть воздух или есть подозрение на воздух в системе. Промойте систему водой вручную с помощью системного контроллера или с помощью автоматического метода. Следите за тем, чтобы давление, проводимость, отслеживание UV280 и pH оставались постоянными, а предел давления для колонки не превышался в соответствии со спецификацией производителя><.
заметка: Аномалии могут указывать на засорение воздуха или системы, которые следует устранить, прежде чем продолжить.
- В модуле системного контроллера запустите расход со скоростью 1 мл/мин вручную с помощью насоса A в положении нагрузки (минуя контур отбора проб) или впрыска (через контур отбора проб), чтобы начать подключение колонки. Отсоедините системную трубку на входе в положение колонны и снимите пробку, подключенную к входу колонны.
- Дайте воде стекать из системной трубки по капле в верхней части колонны, затем прикрепите системную трубку к колонне. Переполнение входного отверстия колонны и впускного штуцера каплями воды обеспечивает отсутствие пузырьков воздуха в соединении.
- Прикрепите выпускное отверстие колонны к выходу ниже по потоку и убедитесь, что все фитинги плотно закреплены. Теперь, когда колонна подключена к системе, не превышайте пределы максимального давления и расхода, указанные в технических характеристиках колонны.
- Промывочная колонна с 5 колонными объемами (CV) воды. При необходимости продолжайте промывку колонн до стабилизации трассировки UV280.
- Погрузите входные трубки A в буфер для связывания, B в буфер для элюирования и насос для отбора проб в буфер для связывания, чтобы уравновесить систему в правильных буферах. Заполните входные трубки буфером с помощью PumpWash вручную.
- В модуле "Редактор методов" программного обеспечения используйте мастер методов для настройки метода аффинной хроматографии для столбца, который предполагается использовать.
заметка: Автоматизированные системы FPLC поставляются с методами, предварительно заполненными рекомендуемыми настройками (т.е. расходом и пределом давления) и шагами выполнения в зависимости от выбранной для очистки колонки (производителя, матрицы и размера).
- Используйте следующие шаги для аффинной хроматографии белка А:
- Уравновешивайте систему с 5 CV связующего буфера и собирайте поток в контейнер для отходов.
- Загрузите пробу в колонну (объем для загрузки указывается вручную в методе) и соберите проточный поток в отдельную емкость.
- Промываем систему с 5 CV связующего буфера и собираем сквозным потоком в отдельную емкость.
- Элюирующую колонку с изократическим фракционированием 5 CV с использованием элюирующего буфера и сбор очищенного образца антител в виде фракций с помощью сборщика фракций.
- Уравновешивайте систему с 5 CV связующего буфера и собирайте поток в контейнер для отходов.
- После настройки метода укажите объем кондиционированной среды, которая будет применена к колонке, и сохраните метод.
заметка: Указанный объем в методе должен быть на 5-10 мл меньше фактического объема, чтобы избежать введения воздуха во время прогона пробы. Указанный объем, используемый в данном протоколе, составляет 90-120 мл.
- Погрузите трубку насоса для отбора проб в сосуд, содержащий кондиционированную среду.
- Подготовьте отдельный контейнер для сбора пробы, проходящей через указанную выходную трубку.
заметка: Сбор данных о проточном потоке имеет важное значение в случае, если во время прогона возникает ошибка или превышена связующая способность колонны, что требует повторного нанесения проточного потока на колонну или повторения очистки.
- Подготовьте сборные пробирки в сборнике фракций. Добавьте 100 μл нейтрализационного буфера на 1 мл объема фракции. Система FPLC автоматически вымывает фракции в сборные пробирки.
- В модуле «Управление системой» программного обеспечения откройте метод для запуска.
заметка: Запуск метода инициируется в виде серии страниц, которые включают в себя проверку переменных метода, настройку сборщика дробей и определение имени файла результатов и места хранения.
- Нажмите кнопку СТАРТ, чтобы начать прогон. Пробег можно контролировать в модуле «Управление системой».
- По окончании цикла очистки проверьте полученную хроматограмму в модуле «Оценка» в программном обеспечении системы.
- Соедините все белоксодержащие фракции в отдельную пробирку, замените буфером и сконцентрируйте в PBS с помощью центробежного фильтрующего устройства с отсечением молекулярной массы 30 кДа. Выполните этапы центрифугирования в соответствии с инструкциями производителя.
- Измерьте концентрацию антител с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA) в соответствии с инструкциями производителя.
- Если необходимо выполнить еще один цикл очистки, загрунтуйте трубку насоса для отбора проб в буфере для связывания и повторите шаги 1.9-1.14.
- По завершении циклов очистки погрузите входные трубки А, В и насос для отбора проб в сверхчистую воду и промойте систему и колонну, как показано на этапе 3.
- Погрузите трубки А, В и насоса для отбора проб в 20% этанол и повторите процедуру промывки для хранения системы и колонны.
- Отсоедините колонку от выходного отверстия ниже по потоку и замените стопорную трубку, затем отсоедините колонну на входе и замените пробку, снова подключите трубку к системе. Хранить колонку при температуре 4 °C.