Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка тканей
- Приготовьте 4% формальдегид в 0,1 М фосфатном буфере pH 7,4 за сутки до перфузии. Хранить при температуре 4 °C.
- Транскардиально перфузирируйте мышей с глубокой анестезией (3,5% изофлуран) через левый желудочек 10 мл ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS), затем 40 мл ледяного формальдегида (скорость потока 5 мл/мин). Препарируйте мозг и постфиксацию в том же фиксаторе в течение 24 часов при 4°C.
- Последовательно переведите мозг на 10% (24 часа при 4°C) и 30% сахарозы (до тех пор, пока мозг не опустится, около 48 часов). Для замораживания медленно погружайте криозащищенный мозг в изопентан при температуре -25 °C до тех пор, пока из ткани не появятся пузырьки. Хранить при температуре -80 °C.
- Вырезать коронковые срезы толщиной 40 мкм на замораживающем микротоме (температура блока от -25 до -16 °С). Последовательно переведите секции в раствор антифриза, содержащий лунки 24-луночного планшета для культивирования клеток (см. рис. 1). Хранить при температуре -20 °C.
2. Иммуноокрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы обрабатываются в свободном режиме, обычно в 6-луночных планшетах, оснащенных несущей пластиной и сетчатыми вставками. В виде исключения реакции блокирования, инкубации антител и авидин-биотинового комплекса (ABC) проводят в 12- или 24-луночных планшетах без сетчатых вставок (достаточно от 0,5 до 1 мл на лунку, в зависимости от количества срезов, которые необходимо окрашивать). Во время этих действий перекладывайте срезы с помощью тонкой щетки (промывайте каждым новым раствором). Все инкубации проводятся при непрерывном перемешивании (макс. 150 об/мин).
- Иммуногистохимия (метод ABC)
- Переложите секции антифриза в трис-буферный физиологический раствор (TBS) и тщательно промойте (один раз O/N при 4 °C, 5 раз при комнатной температуре [RT] в течение 10 минут каждая), чтобы полностью удалить антифриз.
- Чтобы погасить активность эндогенной пероксидазы, инкубируйте в течение 30 минут в 1,5% H2O2 в TBS-Tween 20 (TBS-T). Обратите внимание на барботирование и повторное погружение секций при необходимости. Смойте 3 раза в TBS по 15 минут каждый.
- Дополнительно: Тем временем нагрейте нагревательный шкаф и 2 N HCl до 37 °C. Чтобы денатурировать ДНК, инкубируйте срезы в течение 30 мин при 37 °C в 2 N HCl. Аккуратно разделите срезы с помощью щетки.
- Дополнительно: Нейтрализовать секции в течение 10 мин в 0,1 М боратном буфере pH 8,5, RT. Во время переноса кратко промокните сетчатые вставки, содержащие срезы, на бумажном полотенце, чтобы удалить остатки HCl. Промыть 2 раза в TBS по 15 мин.
- Инкубируйте в TBSplus для проникновения в ткань и блокирования неспецифических сайтов связывания антител в течение 1 часа во время ЛТ.
- Инкубировать в первичном антителе, разведенном в TBSplus, O/N при 4 °C. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 мин каждый.
- Инкубировать в биотинилированном вторичном антителе, разведенном в TBSplus, в течение 3 часов при РТ. Промыть 3 раза в TBS по 15 мин каждый. Тем временем...
- Приготовьте комплекс АВС в соответствии с протоколом производителя (1% А + 1% В в TBS-T). Перед использованием дайте постоять 30 минут при температуре RT. Срезы инкубировать в реагенте АВ в течение 1 ч при РТ. Промыть 3 раза в ТБС по 15 мин.
- Приготовьте 50 мл 0,5 мг/мл 3,3'-диаминобензидина (DAB) в TBS-T на 6- или 12-луночный планшет, разделенный на две половины, и пипеткой 4 мл или 2 мл на лунку соответственно. Перенос секций в DAB-решение (ВНИМАНИЕ! DAB токсичен. Следуйте конкретным паспортам безопасности, предоставленным поставщиком, т. е. наденьте лабораторный халат и перчатки и используйте вытяжной шкаф для химических веществ).
- Добавьте 0,5 мл 1% H2O2 к оставшимся 25 мл раствора DAB, перемешайте и пипетируйте эквивалентные объемы, как указано выше, в каждую лунку, чтобы начать реакцию пероксидазы. Инкубировать в течение 12 минут. Смойте 3 раза в TBS по 15 минут каждый.
- Закрепите секции на предметных стеклах в желатине и высушите на воздухе O/N. Покровное стекло с постоянным монтажным носителем.
- Опционально: Контрокрашивание перед установкой coverslip.
заметка: Если отношение сигнал/шум низкое из-за высокого фона, повторите обработку H2O2 после инкубации реагентом AB (шаг 2.1.8).
- Множественная иммунофлюоресценция
- Однократная или одновременная множественная иммунофлюоресценция
- Переложите секции из антифриза в TBS и тщательно промойте (один раз O/N при 4 °C, 5 раз при RT по 10 мин каждый), чтобы полностью удалить антифриз.
- Необязательно: как шаги 2.1.3 - 2.1.4.
- Инкубируйте в TBSplus для проникновения в ткань и блокирования неспецифических сайтов связывания антител, 1 ч в ЛТ.
- Инкубируйте в первичном коктейле антител (например, крыса α-BrdU (бромоксиуридин), морская свинка α-DCX (даблкортин), козий α-GFP (зеленый флуоресцентный белок)), разведенный в TBSplus, O/N при 4°C. Промойте 3 раза в TBS в течение 15 мин каждый.
- Инкубируют в коктейле из конъюгированных с фторхромом вторичных антител (например, Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-marine pig, Alexa-488 α-goat; все получены от осла), разведенных в TBSplus, 3 часа при RT или O/N при 4 °C. Отныне защищайте секции от света. Смойте 3 раза в TBS по 15 минут каждый.
- Закрепите секции на предметных стеклах в желатине и высушите на воздухе в течение ночи (O/N). Покровное стекло с водной монтажной средой.
- Последовательная множественная иммунофлюоресценция первичными антителами от одного и того же вида хозяина
- В качестве подпунктов 2.2.1.1 - 2.2.1.3.
- Инкубировать с первым первичным антителом (например, кроличьим α-антигеном А), М/Н при 4 °С. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
- Инкубируют в первом вторичном антителе, конъюгированном с фторохромом (например, Rhodamine Red-conj. donkey α-rabbit), 3 ч RT. Отныне защищайте секции от света. Промойте 3 раза в TBS и один раз в TBS-T по 10 минут каждый.
- Инкубируйте в 10% нормальной сыворотке от того же хозяина, что и первичные антитела (например, сыворотка кролика) в течение 3 часов RT для насыщения открытых паратопов на первом вторичном антителе. Промойте 3 раза в TBS и один раз в TBS-T по 10 минут каждый.
- Инкубируют в TBSplus с 50 мкг/мл неконъюгированных моновалентных Fab-фрагментов, направленных против хозяина первичных антител (например, α-кроличьего IgG (H+L)) для покрытия эпитопов, которые могут быть распознаны вторым вторичным антителом, O/N при 4 °C.
- Смойте не менее 3 раз в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 минут каждый. Во время переноса кратко промокните сетчатые вставки, содержащие секции, на бумажном полотенце, чтобы удалить остатки Fab.
- Инкубировать со вторым первичным антителом (например, кроличьим α-антигеном B), O/N при 4 °C. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
- Инкубировать во втором вторичном антителе, конъюгированном с фторохромом (например, Alexa-488-conj. donkey α-rabbit), 3 часа RT. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 мин каждое, установить и закрыть крышкой, как указано выше.
заметка: Для мечения антигенов антителами от различных видов хозяев добавьте их к шагу 2.2.2.2, а соответствующие вторичные антитела — к шагу 2.2.2.3.
