$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка животных
- Обезболите мышей с помощью 3% изофлурана. Вскройте грудную клетку, сделав горизонтальный разрез в области над средней частью живота и подтянув кожу. Аккуратно сделайте еще один разрез, чтобы открыть грудную полость без прокола каких-либо других органов.
- Перфузию сердца сначала через верхушку, а затем правый желудочек с помощью холодного 3% глутаральдегида в кардиоплегическом растворе (50 мМ KCl, 5% декстрозы в PBS, см. табл. 1) в течение 2 мин для обеспечения полного расслабления миокарда.
- Перфузируйте сердце с помощью ледяного 3% глутаральдегида в 0,1 М буфера какодилата натрия (pH 7,4) в течение еще 2 мин. Используя гравитационное давление, используйте иглу 25 G 5/8" для введения фиксаторов в сердце. Сразу после того, как сердце начнет заполняться фиксатором, поднимите верхушку сердца и разрежьте сосуды под ним на расстоянии 1-2 мм от сердца, чтобы снизить давление и дать жидкости стечь.
- Врежьте сердце, удалите предсердия и опустите желудочки в ледяной 3% глутаральдегид/0,1 М какодилат натрия в чашке Петри. Сделайте надрез бабочки через 30-60 минут фиксации и поместите его в чашку Петри, содержащую 3% глутаральдегида/какодилата (см. Таблицу материалов). Разрежьте сердце хирургическим лезвием небольшими кубиками по 1мм3, пока оно находится в растворе глутаральдегида/какодилата.
- Зафиксировать/погрузить рассеченную ткань сердца в раствор глутаральдегида/какодилата на 24 ч при температуре 4 °С.
2. Обработка сердечной ткани
- Через 24 ч после фиксации промойте ткани в 0,1 М буфера какодилата натрия в течение 20 мин.
- Приготовьте 0,1 М какодилатный буфер, выполнив следующие действия.
- Для приготовления 0,1 М буфера из какодилата натрия готовят запас 1 М буфера из какодилата натрия, растворяя в 90 мл дистиллированной воды какодилат натрия (21,4 г) и 1% раствор хлорида кальция (3 мл). Увеличьте объем раствора до 100 мл, добавив дистиллированную воду. Хорошо размешайте раствор и оставьте на ночь, чтобы растворенное вещество растворилось.
- Далее возьмите 10 мл 1 М раствора какодилата натрия и добавьте его в 80 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью HCl и увеличьте его до 100 мл, добавив дистиллированную воду.
- Повторите промывку в 0,1 М буфере из какодилата натрия еще 20 мин. Извлеките салфетки из буфера какодилата натрия и погрузите их в 2% раствор тетраоксида осмия на 4 ч при комнатной температуре. Этот процесс называется осмикацией.
- Приготовьте 2% раствор тетраоксида осмия, выполнив следующие действия.
- Чтобы приготовить 2% раствор тетраоксида осмия, возьмите 4% раствор тетраоксида осмия, 4 мл (см. Таблицу материалов), 1 М стоковый раствор какодилата натрия (0,8 мл) и дистиллированную воду (3,2 мл), чтобы получить в общей сложности 8 мл раствор><а.
заметка: Весь этот процесс и дальнейшие шаги должны выполняться в вытяжном шкафу.
- После осмикации погрузите ткани в 2% раствор ацетата натрия на 10 мин при комнатной температуре.
- Приготовьте 2% раствор ацетата натрия, растворив 4 г ацетата натрия в 20 мл дистиллированной воды.
- Далее погрузите ткани в 2% раствор уранилацетата на 1 ч при комнатной температуре.
- Приготовьте 2% раствор уранилацетата, растворив 4 г уранилацетата в 20 мл дистиллированной воды.
- После окрашивания уранилацетатом последовательно обезвоживайте ткани с помощью градуированных спиртов и ацетона в порядке, указанном в таблице 2.
3. Встраивание сердечной ткани
- Поместите обезвоженные ткани в эпоксидную смолу с низкой вязкостью, выполнив следующие действия.
- Чтобы получить эпоксидную смолу с низкой вязкостью, смешайте 10,24 мл эпоксидного мономера винилциклогексендиоксида, 6,74 мл диглицидилового эфира полипропиленгликоля (DER 732) и 30,05 мл нонеенилянтарного ангидрида (NSA) (см. Таблицу материалов) в пробирке объемом 50 мл. Хорошо перемешайте суспензию вручную в течение 2 минут.
- Добавьте 18 капель 2-диметиламиноэтанола (ДМАЭ, см. Таблицу материалов) эпоксидного ускорителя и перемешайте суспензию, чтобы компоненты тщательно перемешались.
- Пропитайте ткани эпоксидной смолой в следующей последовательности приготовления смеси.
- Замените 100% ацетон на суспензию смолы 1:1: ацетона и погрузите в нее ткани на 1 ч при комнатной температуре.
- Замените смолу: ацетоновую суспензию 1:1 на смолу 6:1: ацетоновую суспензию и погрузите в нее ткани на 3 ч.
- Наконец, замените суспензию смолы: ацетона в соотношении 6:1 на суспензию 100% смолы и оставьте ткани погруженными в нее на ночь при комнатной температуре.
- Поместите салфетки в свежую смолу в микроформы диаметром 8 мм (см. Таблицу материалов) и отверждите внедренные ткани при температуре 70 °C в течение ночи><.
заметка: Убедитесь, что смола твердая, но не хрупкая после отверждения.
4. Разрезание ткани с помощью ультрамикротома
- Перед установкой на ультрамикротом блоки смолы с салфеткой обрежьте не более чем на 1 мм (см. Таблицу материалов). Поместите форму как можно точнее в сегментированный кронштейн ультрамикротома и вручную переместите форму для образца к алмазному ножу.
- Разрежьте срезы толщиной 500 нм (полмикрона) с помощью Histo ножа (см. Таблицу материалов), а затем с помощью инструмента EM loop возьмите их и поместите на предметное стекло.
- Поместите предметное стекло на горячую плиту для синего пятна толуидина, чтобы найти интересующую область.
- Найдя интересующую область, используйте нож Ultra 45° (см. Таблицу материалов) для получения ультратонких срезов бледного золота (100 нм). Поместите эти ультратонкие секции на тусклую сторону медной сетки 200 меш.
5. Ультратонкое окрашивание сердечных сечений
- Начните окрашивание с демаскирования антигена с помощью протравливающего раствора, т.е. 5% раствора метапериодата натрия.
- Приготовьте 500 мкл 5% раствора метапериодата натрия (см. Таблицу материалов) в дистиллированной воде.
заметка: Перед применением приготовьте свежий раствор.
- Налейте 20 мкл раствора метапериодата натрия на чистую парафиновую пленку. Поместите полностью высохшие сетки с тканевыми срезами на каплю протравливающего раствора.
заметка: Матовая сторона сетки с тканевым участком должна быть обращена в сторону протравливающего раствора.
- Оставьте сетку сечения на растворе на 30 минут при комнатной температуре.
- Промойте протравленный участок ткани, поместив его на каплю дистиллированной воды на 60 с.
- Заблокируйте остаточные альдегиды, поместив секционные сетки на каплю 0,05 М раствора глицина на 10 мин при комнатной температуре. Промокните края сетки на фильтровальной бумаге, чтобы удалить остатки раствора глицина.
- Приготовьте 0,05 М раствор глицина (см. Таблицу материалов), растворив 3,75 мг глицина в 1 мл 1x PBS (pH 7,4).
- Поместите секционные сетки в 10-20 μл блокирующего раствора на 25 минут при комнатной температуре.<бр/>
заметка: Состав блокирующего раствора: 2 мкл 1% нормальной сыворотки крови коз (NGS) + 20 мкл 1% BSA (конечная концентрация: 10%) + 178 мкл 1x PBS (pH 7,4) для получения конечного объема 200 μл.
- Промокните края сетки на фильтровальной бумаге и поместите секцию сетки на разбавитель антител для кондиционирования при комнатной температуре на 10 минут.
- Инкубируйте секции сетки с первичным антителом (в данном случае Sigmar1, см. Таблицу материалов; разведенный в соотношении 1:10 в разбавителе антитела) в течение 1 ч 30 мин в увлажненной камере.
- Промокните сетку насухо и промойте участки сетки разбавителем антител дважды по 5 мин каждый.
- Инкубируют сеточные участки с биотинилированным вторичным антителом (в данном случае биотинилированным поликлональным вторичным антителом козы против кролика, см. Таблицу материалов; разведенное в соотношении 1:10 в разбавителе антитела) в течение 1 ч во увлажненной камере.
- Промокните сетку насухо и промойте участки сетки разбавителем антител дважды по 5 мин каждый.
- Инкубируйте секции сетки в коммерчески доступном стрептавидин-конъюгированном QD (QD655 нм, см. Таблицу материалов; разбавленный 1:10 в разбавителе антитела) в течение 1 ч во влажной камере при комнатной температуре. Не допускайте попадания света, накрыв камеру алюминиевой фольгой.
- Промокните, обсушите края сетки фильтровальной бумагой и промойте секции сетки, поместив их на капли воды на 2 минуты.
- Промокните края сетки до полного высыхания.
Таблица 1: Состав PBS и других растворов, используемых для обезвоживания тканей.
| буфер | состав | количество |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) (1x) (1 л) | Хлорид натрия | 8 г |
| Хлористый калий | 0,2 г |
| Натрия фосфат двухосновной | 1,44 г |
| Фосфат калия одноосновной | 0,24 г |
| Отрегулируйте pH до 7,4 | |
Таблица 2: Применение дифференцированного спирта и ацетона для дегидратации тканей (Шаг 2.5)
| компонент | Время |
| 50% этанол | 10 мин |
| 70% этанол | 10 мин |
| 95% этанол | 10 мин |
| 100% этанол | 20 мин |
| 100% этанол | 20 мин |
| 100% ацетон | 30 мин |
| 100% ацетон | 30 мин |