$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка животных и фиксация почек
- Выполните перфузионную фиксацию, выполнив следующие действия.
- Обезболивайте мышей путем ингаляции изофлурана (3%, 2,0 л/мин) и внутрибрюшинного введения медетомидина гидрохлорида (0,3 мг/кг), тартрата буторфанола (5 мг/кг) и мидазолама (4 мг/кг) (см. Таблицу материалов).
- Перфузируют животное 20 мл фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,4) и 30 мл 4% параформальдегида (PFA) в фосфатном буфере (PB) через левый желудочек сердца.
- Иммерсионную фиксацию проводят сразу после перфузионной фиксации и забора почки.
- Погрузите почку в 4% PFA при температуре 4 °C еще на 16 часов, затем промойте ее PBS в течение 2 часов (три раза)9 (Рисунок 1).
осторожность: Формальдегид и параформальдегид являются токсичными раздражителями. Работать с реагентами следует в вытяжном шкафу с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
2. Обесцвечивание и удаление липидации
- Приготовьте CUBIC-L (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis) для обесцвечивания и делипидации, состоящий из 10 мас.% Triton X-100 и 10 мас.% N-бутилдиэтаноламина, в соответствии с ранее опубликованными отчетами.
- Выполните обесцвечивание и удаление липидации с помощью CUBIC-L, выполнив следующие действия.
- Погрузите неподвижную почку в 7 мл 50% (v/v) CUBIC-L (смесь воды и CUBIC-L 1:1) в пробирку с круглым дном объемом 14 мл (см. Таблицу материалов) с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение 6 часов (Рисунок 2A). Затем погрузите его в 7 мл CUBIC-L в пробирку с круглым дном объемом 14 мл с легким встряхиванием при температуре 37 °C на 5 дней.
- Обновляйте CUBIC-L каждый день во время этого процесса. После процесса обесцвечивания и делипидации промойте почку PBS при комнатной температуре в течение 2 ч (три раза) (Рисунок 1). Используйте дозирующую ложку для работы с образцами (рисунок 2B).
3. Цельное иммунофлуоресцентное окрашивание
- Подготовьте буферы для окрашивания.
- Приготовьте окрашивающий буфер для первичных антител, смешав 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,5% казеина в PBS и 0,05% азида натрия.
- Приготовьте окрашивающий буфер для вторичных антител путем смешивания 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,1% казеина в PBS и 0,05% азида натрия.
- Проводят окрашивание первичными антителами.
- Иммуноокрашивание очищенной почки первичными антителами (1:100 или 1:200, см. Таблицу материалов) в окрашивающем буфере при температуре 37 °С с легким встряхиванием в течение 7 дней.
заметка: Количество буфера для окрашивания, необходимого для одной почки, составляет 500-600 мкл (рис. 2C).
- Промойте почку 0,5% (v/v) Triton X-100 в PBS (PBST) при комнатной температуре в течение 1 дня (Рисунок 1).
- Проводят окрашивание вторичными антителами.
- Иммуноокрашивание почки вторичными антителами (1:100 или 1:200, см. Таблицу материалов) в окрашивающем буфере при температуре 37 °С с легким встряхиванием в течение 7 дней. Промойте почку PBST при комнатной температуре в течение 1 суток (рисунок 1).
- После фиксации погрузите почку в 1% формальдегид в PB (смесь 37% формальдегида и PB в соотношении 1:36) на 3 ч и промойте PBS при комнатной температуре в течение 6 ч (рис. 1).
4. Согласование показателя преломления (RI)
- Приготовьте CUBIC-R+.
- Приготовьте CUBIC-R путем смешивания 45 мас.% 2,3-диметил-1-фенил-5-пиразолона/антипирина и 30 мас.% никотинамида (см. Таблицу материалов).
- Подготовьте CUBIC-R+ для согласования показателя преломления (RI) путем добавления 0,5 v% N-бутилдиэтаноламина в CUBIC-R в соответствии с ранее опубликованными отчетами.
- Выполните сопоставление RI.
- Погрузите почку в 7 мл 50% (v/v) CUBIC-R+ (смесь воды и CUBIC-R+ 1:1) в пробирку с круглым дном объемом 14 мл с легким встряхиванием при комнатной температуре на 1 сутки. Затем погрузите его в 7 мл CUBIC-R+ в пробирку с круглым дном объемом 14 мл с легким встряхиванием при комнатной температуре на 2 дня (рис. 1).
заметка: Несмотря на то, что в начале RI-сопоставления почка плавает в 50% CUBIC-R+, в конце процесса она опускается и становится прозрачной в CUBIC-R+ (рис. 2D).
5. Получение и восстановление изображений
- Погрузите RI-совместимую почку в смесь силиконового масла (RI = 1,555) и минерального масла (RI = 1,467) (55:45) во время получения изображения (RI = 1,51) (рис. 3).
- Получите 3D-изображения всей почки с помощью специально изготовленного флуоресцентного микроскопа на световом листе (см. Таблицу материалов). Соберите все необработанные данные изображения в 16-битном формате TIFF. Визуализируйте и захватывайте 3D-изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений (Imaris, см. Таблицу материалов).
