Иммунофлуоресцентный анализ для выявления агрегатов альфа-синуклеина в биопсийном срезе кожи

Аннотация

Источник: Vacchi, E., et al. Нацеливание на агрегаты альфа-синуклеина в кожных периферических нервных волокнах с помощью свободно плавающего иммунофлуоресцентного анализа. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения агрегатов альфа-синуклеина, специфичных для нейродегенеративных заболеваний, на срезах биопсии кожи. Свободно плавающее иммуноокрашивание используется для флуоресцентного мечения карбоксил-концевой гидролазы и агрегатов альфа-синуклеина в дермальных нейронах. Под конфокальным микроскопом клетки с флуоресценцией обоих антител указывают на наличие агрегатов альфа-синуклеина в дермальных нейронах.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB,

1. Забор биопсии кожи

1. Квалифицированный врач проведет биопсию кожи в соответствующих клинических условиях.
2. Выберите зону для проведения биопсии кожи и очистите ее спиртовым тампоном.
3. Приготовьте обезболивающий раствор с 1 мл лидокаина 2%.
4. С помощью иглы параллельно этой области введите местную анестезию подкожно.
5. После проверки эффекта анестезии возьмите одноразовый перфоратор диаметром 3 мм и надавите вращательным и деликатным нисходящим давлением, вращая его вниз через эпидермис и дерму, пока не будет достигнут подкожный жир.
6. Снимите удар.
7. С помощью одноразовых щипцов аккуратно вытяните кожную пробку вверх.
8. С помощью ножниц вырезайте основание образца на уровне жировой ткани.
9. Поместите образец в пробирку, содержащую 10 мл фиксирующего раствора периодат-лизин-параформальдегид (PLP).
10. Продезинфицируйте участок и накройте его лейкопластырной повязкой.

2. Фиксация и хранение тканей

1. Приготовьте свежий фиксирующий раствор PLP (см. таблицу 1).
2. Сразу после забора биопсии кожи погрузите ее в пробирку, содержащую 10 мл фиксирующего раствора PLP, и инкубируйте в течение ночи (O/N) при 4 °C.
3. На следующий день под вытяжной шкаф аккуратно снять фиксатор PLP и в той же пробирке промыть биопсию 3 раза в течение 5 мин 5 мл 0,1 М раствора Соренсена (табл. 1).
4. Выбросьте раствор Соренсена и инкубируйте биопсию с 5 мл раствора криопротектора O/N при 4 °C.
5. Хранить биопсию при температуре 4 °C, если разрез с помощью криотома выполнен в течение 1 недели; хранить биопсию при температуре -20 °C, если разрез выполнен в течение 3 месяцев; встроить биопсию в криомол (шаги 3.2-3.4) и хранить при температуре -80 °C, чтобы сохранить ее в течение более длительного периода времени.

3. Разрез ткани с помощью криотома

1. Установите криотом на -20 °C.
2. Возьмите криомолд и заполните его криосредой для встраивания. Избегайте образования пузырей.
3. С помощью пинцета погружают биопсию в криовстраиваемую среду продольной осью (эпидермис – дерма) параллельно дну криоформы.
4. Snap заморозьте образец жидким азотом, чтобы получить твердый куб криогиндирующей среды, содержащий биопсию в правильной ориентации.
5. Поместите образец в криостат и подождите 30 минут, чтобы биопсия акклиматизировалась.
6. Закрепите образец на криостате и разрежьте срезы 50 мкм.
7. С помощью небольшой щетки перенесите криосекции в 96-луночную пластину, содержащую 200 μл раствора антифриза в каждой лунке. Одна секция на скважину.
8. Хранить при температуре -20 °C.
   заметка: Если при анализе не анализируется вся биопсия, сократите ее только частично. В этом случае срезы должны храниться при температуре -20 °C, а оставшаяся часть биопсии при -80 °C, чтобы сохранить ее в течение более длительного периода времени.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Заполните 96-луночную пластину 100 μл моющего раствора.
2. Перенесите анализируемые срезы из накопительной пластины в новую, содержащую раствор для умывания. 1 срез на каждую лунку (4 срезы на анатомический участок, на одного пациента: обычно всего 12 срезов на одного пациента).
3. Оставьте секцию в моющем растворе на 10 минут при комнатной температуре (RT). Переложите срез в другую лунку, содержащую тот же раствор, и повторите промывку.
4. Переместите секции в новые лунки, содержащие 100 μл блокирующего раствора, и инкубируйте не менее 90 мин и не более 4 ч при RT.
5. В рабочем растворе разведите первичные антитела anti-PGP9.5 (Rabbit polyclonal, 1:1000) и anti-5G4 (Mouse monoclonal, 1:400).
6. Срезы перенести в новые лунки, содержащие 100 мкл рабочего раствора первичных антител, и инкубировать их М/Н при ЛТ.
7. В качестве шага 4.3 промойте секции 2 раза в течение не менее 10 минут при температуре RT 100 мкл моющего раствора.
8. Развести вторичные антитела (конъюгировать с различными флуорофорами) Goat Anti-Rabbit для обнаружения PGP9.5 (1:700) и Goat anti-Mouse для обнаружения 5G4 (1:700) в рабочем растворе.
9. Переведите срезы в новые лунки, содержащие 100 мкл рабочего раствора вторичных антител, в течение 90 мин при ЛТ. С этого момента накройте 96-луночный планшет алюминиевой фольгой, чтобы избежать обесцвечивания флуорофора, конъюгированного со вторичными антителами.
10. В качестве шага 4.3 промойте секции 2 раза в течение не менее 10 минут 100 мкл моющего раствора.
11. Перенесите секции в новые лунки, содержащие 100 мкл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, разведенный в соотношении 1:5000 в фосфатно-солевом буфере [PBS] 1x) в течение 5 мин при RT.
12. В качестве шага 4.3 промойте секции 2 раза в течение не менее 10 минут 100 мкл моющего раствора.
13. Установите секции на слайд в правильном положении, не допуская неправильного складывания.
14. Добавьте несколько капель монтажного носителя на предметное стекло и накройте покровным стеклом.
15. Дайте предметным стеклам высохнуть O/N перед использованием конфокального/флуоресцентного микроскопа.
16. Храните предметные стекла в соответствующей упаковке при температуре 4 °C, избегая воздействия света. При правильном хранении сигнал будет виден около 6 месяцев.
    заметка: Перенос среза с 96-луночной пластины, содержащей только что вырезанные срезы, на 96-луночную пластину, содержащую промывочный раствор (шаг 4.1), выполняется с помощью небольшой кисточки, которая помогает получить биопсию. После переноса среза в первую лунку, каждый раз, когда срез нужно инкубировать с разным раствором, перемещайте его из лунки в лунку с помощью щетки.

5. Иммунофлуоресцентная визуализация

1. Просматривайте срезы под инвертированным флуоресцентным микроскопом или конфокальным микроскопом (увеличение 20X, 40x или выше, используйте последовательные кадры с шагом 2 мкм по схеме Z-стека для достижения наилучших результатов).
2. Получение изображений с помощью камеры, подключенной к микроскопу
3. Используйте подходящее программное обеспечение для обработки изображений (например, ImageJ) для анализа положительных сигналов в разрезах с точки зрения пространственного распределения и интенсивности сигнала. Для этого выполните действия, указанные ниже.
   1. Откройте файл с помощью программы ImageJ.
   2. Нажмите на Изображение > цветом > разделенные каналы, чтобы проанализировать каждый цветовой канал.
   3. Щелкните Изображение > сложить > проект Z, чтобы получить слияние нескольких приобретенных разделов.
   4. Щелкните Изображение > цвет > объединить каналы, чтобы получить слияние различных цветовых каналов одного и того же приобретения.

Таблица 1: Требуемые решения. Список необходимых решений для протокола и краткое описание того, как его подготовить.

Раствор антифриза (хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев)	30% глицерин<бр /> 30% этиленгликоль<бр /> 30% dH2O 10% 2x фосфатный буфер
Решение для блокировки (готовятся на данный момент)	4% Обычная козья сыворотка<бр /> 1% Тритон Х-100<бр/> in Моющий раствор
Криопротектор<br /> (хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев)	20% глицерин<бр /> 80% раствор Соренсена
Раствор гидрофосфата натрия (хранить в RT до 6 месяцев)	0,45М динатрия гидрофосфат (Na2HPO4) в dH2O Фильтр в стерильной бутылке
Раствор лизина (хранить при температуре 4 °C до 3 недель)	50% 0,3М раствор L-лизина моногидрохлорида 50% от 0,1М раствора Соренсена pH 7,6<бр/> pH 7,4, фильтр в стерильной бутылке
Параформальдегид (PFA) 8% (готовить под вытяжным шкафом и хранить при температуре 4 °C до 1 месяца)	2,6М PFA в dH2O (до 55°C_do не более 60°C для предотвращения образования муравьиной кислоты) Процедить в стерильную бутылку
Фосфатный буфер 2x (хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев)	6% раствор мононатрийфосфата (2PO4) <бр /> 45% раствор динатрийфосфата (Na2HPO4) в dH2O
Фиксатор PLP (готовьте в данный момент, под вытяжным шкафом )	25% Параформальдегид 8% 0,01M натрия (мета)периодат 75% раствор лизина
Натрия дигидрофосфата моногидрат (хранить в RT до 6 месяцев)	0,52М натрия дигидрофосфата моногидрат (2PO4*H2O) в dH2O Процедите в стерильную бутылку.
Решение Соренсена (хранить при температуре 4 °C до 1 месяца)	2,5% раствор монофосфата<бр /> 18,7% раствор динатрия фосфата<бр /> pH 7,6, в dH2O
Моющий раствор (готовятся на данный момент)	0,25М Тризма база<бр/> 0,26 млн NaCl<бр/> pH 7,6, в dH2O
Рабочий раствор (готовятся на данный момент)	50% Решение для блокировки 50% Моющий раствор

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5G4 (античеловеческий αSyneclein 5G4)	Analytik Jena Roboscreen	847-0102004001	Мышь моноклональная
AlexaFluor 488 Козий антикролик IgG	Инвитроген	1971418	2 мг/мл
AlexaFluor 594 Козий антимышиный IgG	Инвитроген	1922849	2 мг/мл
Раствор гидрофосфата натрия	Мерк Миллипор	106586
Этиленгликоль	Сигма-Олдрич	324558
глицерин	Сигма-Олдрич	Г7757
L-лизин моногидрохлорид	Сигма-Олдрич	Л5626
Параформальдегид	Олдрич Химия	441244
ПГП9.5	Абкам	АБ15503	Кролик поликлональный
Хлорид натрия	сигма	С3014
Натрия дигидрофосфата моногидрат	Мерк Миллипор	106346
Натрия (мета)периодат	Сигма-Олдрич	С1878
База Тризма	сигма	Т1503
Тритон Х-100	Сигма-Олдрич	Х100
Вектащит	Лаборатория «Вектор	Н-1000	Монтажный материал

»