Использование флуоресцентно-опосредованной томографии для оценки воспаления кишечника у мышей

Аннотация

Источник: Nowacki, T. M., et al. Флуоресцентно-опосредованная томография для обнаружения и количественной оценки воспаления кишечника мышей, связанного с макрофагами. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует технику оценки инфильтрации кишечных макрофагов в мышиной модели колита с помощью флуоресцентно-опосредованной томографии (ТФМ). После индуцирования колита у мышей с помощью декстрана сульфата натрия (DSS) животному вводят антитела, которые распознают маркер гликопротеина F4/80 на инфильтрированных макрофагах в толстой кишке. Затем мышь визуализируется в устройстве FMT, где сигналы флуоресценции и отражения реконструируются в трехмерное изображение для определения пространственного распределения и интенсивности флуоресценции.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Материалы и экспериментальная установка

1. Уход за животными.
   1. Используйте мышей соответствующего пола и возраста любого штамма, восприимчивого к DSS (например, C57BL/6) с массой тела 20-25 г.
   2. Планируйте не менее пяти или более мышей в экспериментальной группе и размещайте мышей в соответствии с местными рекомендациями по уходу за животными.
   3. Обеспечьте стандартную диету для грызунов и автоклавную питьевую воду в неограниченном количестве.
   4. Снимите стандартный корм и замените его кормом без люцерны не менее чем за три дня до сканирования, чтобы уменьшить эндолюминальную аутофлуоресценцию.
2. Индукция острого колита, вызванного DSS.
   1. Растворите 2 г DSS (молекулярная масса ~40 000 Да) в 100 мл автоклавированной питьевой воды до получения 2% (w/v раствора).
   2. Заполняйте питьевой запас мышей исключительно раствором DSS и оценивайте 5 мл жидкости на одну мышь в день. Обеспечьте контрольных мышей такой же питьевой водой без DSS.
      заметка: Наблюдайте за мышами ежедневно до конца эксперимента. Усыпляйте мышей, которые теряют более 20% от первоначальной массы тела или становятся умирающими (т.е. постоянно сгорбленными осанками, ограниченной подвижностью, затрудненным дыханием, заметно эрегированной шерстью) в соответствии с местными применимыми рекомендациями по благополучию животных.
3. Подготовка к флуоресцентно-опосредованной томографии.
   1. Пометьте желаемое антитело (например, антитело к мышам крысы F4/80) флуоресцентным красителем (например, Cyanine7,_{λ возбуждение}: 750 нм,_{λ излучение}: 776 нм), как описано в протоколе производителя. Диализное очищенное антитело в соответствующей диализной мембране (размер пор < 50-100 кДа) против 1 л 0,15 М натрия хлорида в течение не менее 2 ч или в течение ночи.
      1. Перенесите антитело в 1 л 0,1 М NaHCO₃ и диализируйте в течение не менее 2 ч.
      2. Растворите необходимое количество флуоресцентного красителя в диметилсульфоксиде (ДМСО) (10,8 мкл/мг антитела) и добавьте его в раствор антитела. Используйте флуоресцентный краситель в 20-кратном избытке моляров, чтобы достичь соотношения красителя к белку 1:3.
      3. Инкубировать в темноте при 4 °C в течение 1 ч. Немеченые антитела удалить диализом против 1 л 0,15 М натрия или с помощью обессоливающей колонки PD-10 и растворить в фосфатно-солевом буфере (PBS) для применения in vivo.
      4. Определите конечную концентрацию антител и коэффициент мечения с помощью спектрофотометрии.
      5. Измерьте концентрацию белка при абсорбции 250-330 нм и рассмотрите возможность дополнительной абсорбции красителем. Скорректировать максимальную абсорбцию при 280 нм (белок) на 11% от максимальной абсорбции при 750 нм (следующий шаг) для мечения цианином.
      6. Измерьте разведение соединения (обычно 1:10) при длине волны 250-800 нм и извлеките концентрацию цианина7 при длине волны 750 нм.
      7. Определите соотношение красителя к белку следующим образом: краситель/антитело = максимальная абсорбция при 750 нм / 200 000 / (максимальная абсорбция при 280 нм - 0,11 x максимальная абсорбция при 750 нм) / 170 000.
      8. Держите раствор антитела при температуре 4 °C и защищайте его от света, чтобы избежать обесцвечивания перед инъекцией.
   2. Загрузите необходимый объем раствора антитела в стерильный шприц непосредственно перед инъекцией и защитите его от света до момента использования.
   3. Определение оптимального времени введения зонда и процедуры сканирования в зависимости от фармакокинетики индикатора.
   4. Обезболите мышей, используя 1,5 - 2,5% ингаляционный изофлуран в кислороде, или надежно поместите их в специальный ограничитель для инъекции меченых антител в хвостовую вену.
   5. Для полноразмерных антител следует ввести меченое антитело не менее чем за 24 часа до сканирования, например, для визуализации макрофагов F4/80 против мышей при мышином колите. Мышам вводят внутривенно (в/в) через хвостовую вену меченое антитело в количестве, соответствующем 2,0 нмоль красителя.
   6. Используйте одинаково меченые неспецифические антитела (например, IgG крысы или другой изотип, соответствующий наследию первичного антитела) в качестве контроля изотипа в дозах, эквивалентных дозам специфического зонда.
      заметка: Результаты сканирования in vivo после введения контрольного соединения могут служить в качестве эталона для интерпретации данных визуализации конкретного зонда.
   7. Используйте электрическую бритву для бритья шерсти животного в области живота, чтобы свести к минимуму отражение и поглощение света.

2. Техническое оснащение

1. Используйте ветеринарный аппарат флуоресцентно-опосредованной томографии (ТФМ) для флуоресценции мелких животных (Рисунок 1).
2. Создайте новое исследование для каждого проекта, нажав кнопку «Новое исследование», и включите в описание исследования соответствующие индикаторы, включая параметры визуализации и дозы для использования в будущем.
3. В рамках этого исследования создайте исследовательские группы в соответствии с соответствующим дизайном исследования (например, для контроля конкретного индикатора и неопределенного изотипа), нажав кнопку «новая исследовательская группа». Оснастите каждую учебную группу соответствующим количеством животных.
4. Откалибруйте систему для конструкций трассировщика.
   1. Выполните калибровку для каждой партии индикаторов, чтобы нормализовать вариации в маркировке и обеспечить количественное измерение на основе данных ОИ.
   2. Следуйте указаниям производителя прибора по калибровке каждой отдельной системы; после выбора параметра «Добавить новый индикатор» система предоставит руководство по всем шагам. Обеспечивают разведение нанесенного раствора антитела и рассчитанную абсолютную концентрацию индикатора в зонде.
   3. Для ТФМ используйте тканеимитирующий фантом определенной толщины и абсорбционных характеристик (напоминающий жизненно важную ткань) и заполните его определенным объемом используемого раствора антитела. Измерьте это на приборе FMT.
      заметка: Система будет использовать эталонные измерения предоставленного зонда вместе с заданной концентрацией для расчета абсолютных концентраций индикаторов на основе будущих измерений in vivo.
5. Используйте нагреваемую кассету для осмотра с температурой 42 °C.
   заметка: Это предотвращает переохлаждение мышей во время обследования.

3. Анестезия животных

1. Используйте непрерывный поток 1,5 - 2% об.% изофлурана ([2-хлор-2-(дифторметокси)-1,1,1-трифтор-этан]) и 1,5 л О₂/мин для обезболивания мышей. Используйте специально разработанные ингаляционные системы для анестезии грызунов (истрофуран вапорайзер) для легкого контроля глубины анестезии и минимизации воздействия на персонал.
2. Поместите мышь в герметичную индукционную камеру и включите испаритель для подачи изофлурана (100% (v/v), 5 об.% в кислороде, 3 л/мин). Следите за мышью до тех пор, пока она не станет лежачей и потеряет сознание.
3. Поместите его в исследуемую кассету для томографии, с непрерывной ингаляцией изофлурана через носовой конус в дозе 100% об./об., 1,5 об.% в кислороде, 1,5 л/мин для минимизации артефактов движения во время исследования. Для процедур продолжительностью более 5 минут нанесите глазную мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить повреждение роговицы.
4. Оцените глубину анестезии, проверив рефлексы. Положите мышь на спину; Если анестезия достаточна, мышь не должна поворачиваться. Мягко сожмите мышь между пальцами ног; Если анестезия достаточна, нога не будет отведена (стадия хирургической толерантности).

4. Флуоресцентно-опосредованное томографическое сканирование

ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости адаптируйте следующие детали, характерные для системы FMT, используемой в этом исследовании (см. Таблицу материалов), для альтернативных устройств визуализации флуоресцентного отражения или систем FMT.

1. Положите мышь, находящуюся под наркозом, на спину в кассете для осмотра.
2. Выполните процедуру сканирования.
   1. Вставьте кассету в систему визуализации и немедленно закройте ее, чтобы обеспечить непрерывную анестезию. Выберите подходящую выборку из ранее созданной исследовательской комиссии. Выберите введенный индикатор из раскрывающегося меню, чтобы убедиться, что значения концентрации индикатора рассчитаны правильно.
   2. Получите флуоресцентное отраженное изображение на соответствующей длине волны (720 нм для Cyanine7) для планирования сканирования и очертите поле сканирования, нажав кнопку «получить изображение».
   3. Убедитесь, что поле сканирования отображается в виде наложения на изображение флуоресцентного отражения. Отрегулируйте его в соответствии с областью интереса (например, толстой кишкой или животом), избегая воздуха или участков оставшейся шерсти. В зависимости от цели изображения задайте количество точек данных изображения в поле сканирования, выбрав в меню справа разрешение от грубого до среднего и тонкого сканирования.
      заметка: Имейте в виду, что точное поле сканирования может обеспечить лучшее пространственное разрешение за счет значительно более длительного времени сканирования.
   4. Начните сбор данных/изображений на выбранной длине волны, нажав кнопку "сканировать"."
      заметка: Время сканирования всей брюшной полости со средней точностью составит около 5 минут; За это время каждая точка данных отдельно подсвечивается возбуждающим лазером, и результирующая флуоресценция записывается.
   5. Извлеките животное из видеокассеты в конце сканирования и дайте животному полностью восстановиться, прежде чем поместить его обратно в клетку.
   6. Повторите ТФМ, если сочтете необходимым, в различные моменты времени в течение эксперимента (например, в дни 0, 5 и 9 - 10 (конец эксперимента)), но учитывайте накопление антител в организме, тем самым увеличивая сигнал фоновой флуоресценции.

5. Реконструкция и интерпретация данных

1. Используйте инструмент реконструкции соответствующего программного обеспечения для создания изображений для создания 3D-карт распределения флуоресценции на основе необработанных данных визуализации; сканы автоматически добавляются в инструмент реконструкции при выборе функции «добавить в очередь реконструкции».
   1. В противном случае выберите сканы из выпадающего меню под соответствующим исследованием и учебной группой, щелкните правой кнопкой мыши скан и выберите «Добавить в реконструкцию».
2. Для дальнейшего анализа загрузите набор данных в аналитическое программное обеспечение. В выпадающем меню на верхней панели выберите соответствующее исследование, а затем выберите группу исследования и отдельное животное в меню справа; Будут показаны все сканирования, выполненные для этого животного. Выберите правильный скан и нажмите кнопку "загрузить."
   заметка: 3D-реконструкция распределения трассеров будет отображаться слева в виде наложения первоначально полученного изображения флуоресцентного отражения. Модель можно поворачивать и увеличивать для упрощения анализа.
3. Выявляйте очаги неспецифического накопления меток (например, печень или мочевой пузырь) на реконструированных 3D-картах и дифференцируйте их от целевых тканей (например, кишечника или кишечника).
4. На верхней панели выберите наиболее подходящую для цели форму ROI. Пометьте целевые ткани как области интереса (ROI), поместив соответствующие измерительные инструменты в программное обеспечение для анализа; программное обеспечение предоставит интенсивность флуоресценции для ROI, а также (пико-)молярное количество индикатора, для которого было откалибровано сканирование.
5. Выберите общее количество индикатора в соответствующем ROI, нормализованное для размера ROI, в качестве наиболее подходящего эквивалента для оценки активности заболевания в корреляции с воспалительным инфильтратом (гистология).
   заметка: Другие характеристики ROI могут быть выбраны, если это уместно, в качестве репрезентативных для конкретной модели.

Результаты

Рисунок 1. Томографическая визуализация инфильтратов макрофагов при мышином колите.

Сканирование ТФМ у мышей с колитиками и контрольной группы без колитов вводили Cyanine7-конъюгированное антитело против мышиного F4/80 (n = 5 в группе). (A) Гистограмма: общая интенсивность флуоресценции в пмоле красителя была определена в ROI и отображена ± SEM...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагентов
Диета без люцерны	Harlan Laboritories, Мэдисон, США	2014
Мазь для глаз Бепантен	Bayer, Леверкузен, Германия	80469764
Декстран сульфат натрия (DSS)	TdB Consulatancy, Уппсала, Швеция	БД001
эозин	Sigma - Aldrich, Дайзенхофен, Германия	Е 4382
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	Sigma - Aldrich, Дайзенхофен, Германия	Е 9884
Флорен 100 В/В	Abbott, Висбаден, Германия	В506
Гематоксилин	Sigma - Aldrich, Дайзенхофен, Германия	HHS32-1L
O.C.T. Ткань Тек компаунд	Сакура, Зоетервонде, Нидерланды	4583	Фиксатор для гистологических анализов
Фосфатно-солевой буфер, PBS	Lonza, Вервье, Бельгия	No 4629
Натрия хлорид 0,9%	Браун, Мельзунген, Германия	12211095.05.0411
Порошок бикарбоната натрия	Sigma Aldrich Deisenhofen, Германия	С5761
Стандартная диета	Altromin, Лаге, Германия	1320
Ткань-Тек Криомолд	Sakura, Лейден, Нидерланды	4566
Гемоккульт (бумажный тест на гваяковой бумаге)	Beckmann Coulter, Германия	3060
Биотин-антитело к мышам анти-F4/80	Serotec, Оксфорд, Великобритания	MCA497B
Биотин крыса-анти-мышь анти-GR-1	BD Pharmingen, Гейдельберг, Германия	553125
Стрептавидин-Алекса546	Молекулярные зонды, Дармштадт, Германия	С-11225	Максимальное возбуждение/излучение: 556/573 нм
Антитела к крысе и мышам против CD11b TC	Calteg, Берлингейм, США	Р2б06
Очищенное антитело против мыши F4/80	BioLegend, Лондон, Великобритания	123102
DAPI	Sigma-Aldrich, Дайзенхоффен, Германия	Д9542
FITC-конъюгированное антитело против Ly6C крысы и мыши	BD Pharmingen, Гейдельберг, Германия	553104
Буфер FACS	BD Pharmingen, Гейдельберг, Германия	342003
Cy7 NHS Ester	GE Healthcare Europe, Фрайбург, Германия	PA17104
МПО ИФА	Immundiagnostik AG, Бенсхайм, Германия	К 6631Б
Меченое Cy5.5 антитело против мыши F4/80	BioLegend, Лондон, Великобритания	123127	готовые к применению меченые антитела (альтернатива)
Антимышиный антиген F4/80 PerCP-Cyanine5.5	eBioscience, Уолтем, США	45-4801-80	готовые к применению меченые антитела (альтернатива)
ДМСО (диметилсульфоксид)	Sigma-Aldrich, Дайзенхоффен, Германия	Тел.: 67-68-5
Изофлуран	Sigma-Aldrich, Дайзенхоффен, Германия	792632
этанол	Sigma-Aldrich, Дайзенхоффен, Германия	Режим 64-17-5
Бычьи сывороточные альбумины (BSA)	Sigma-Aldrich, Дайзенхоффен, Германия	А4612
Трис-буферизованный солевой раствор (TBS)	Sigma-Aldrich, Дайзенхоффен, Германия	SRE0032
оборудование
Система проточной цитометрии FACS Calibur	BD Biosciences GmbH, Гейдельберг, Германия
FMT 2000 Система визуализации in vivo	PerkinElmer Inc., Уолтем, Массачусетс, США	FMT2000
Программное обеспечение для анализа изображений True Quant 3.1	PerkinElmer Inc., Уолтем, Массачусетс, США	Входит в FMT2000
Флуоресцентный микроскоп Leica DMLB	Leica, 35578 Вецлар, Германия	ДМЛБ
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Берлин, Германия	HD 2070	ультразвуковой гомогенизатор
Одноразовый скальпель No 10	Sigma-Aldrich, Дайзенхоффен, Германия	Z692395-10 шт.
Ножницы Метценбаума 14см	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Гайслинген, Германия	22398330
Шприц Luer Lock 5мл	Sigma-Aldrich, Дайзенхоффен, Германия	Z248010
иглы для шприцев	Sigma-Aldrich, Дайзенхоффен, Германия	Z192368
Сокол Туба 50мл	BD Biosciences, Эрембодегем, Бельгия	No 352070 (Английский

г. г. )