Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Проектирование и производство пользовательского массива
- Сгенерируйте электронную таблицу пептидных последовательностей с соответствующими вызовами аллелей. Матрица состоит из 20 строк и 30 столбцов и может содержать до 20x30=600 точек для пептидов. В зависимости от общего количества пептидов, зарегистрированных на шаге 1.5 от одного конкретного донора, и основываясь на нашем прошлом опыте с двумя примерами, которые мы пробовали, массив из 600 точек может содержать все последовательности, сгенерированные из ~2 отдельных случаев трансплантации.
- Рационально спланируйте наиболее эффективный способ подгонки наборов пептидов в рамках 600-точечного формата матрицы.
- Если в один массив может поместиться более одного объекта, вставьте пустые строки после первых последовательностей донора, чтобы они совпали с общим количеством строк, которое можно разделить на 30 (количество мест в строке массива).
- Сразу после последней пустой строки для первого набора последовательностей вставьте весь столбец содержимого последовательности из второго случая трансплантации.
- Повторяйте эти шаги до тех пор, пока массив не заполнится и нельзя будет добавить больше вариантов, не превысив 600 точек. Если в нижней части остались целые пустые строки, «переместите» пустую строку, чтобы расположить ее между двумя наборами-донорами. Это широкое пространство, оставленное между корпусами, облегчает разрезание мембраны после завершения синтеза - следующее шагу 2.2. ниже.
- Программирование пептидных последовательностей в контексте макета массива. Программа синтезатора SPOT принимает текстовый формат последовательностей (одна строка, одна пептидная последовательность), который можно получить непосредственно путем сохранения результирующей таблицы из шага 1.1.4 в виде простого текстового документа (без дополнительных столбцов для имен аллелей, позиций aa и т.д.).
- Запустите автоматический синтез пептидных матриц с помощью синтезатора SPOT. Вся операция синтеза подробно описана в работе Kudithipudi et al. Обратите внимание, что синтез Fmoc двух массивов занимает ~4-5 дней.
2. Зондирование и повторное исследование антисывороток из временного ряда отдельного реципиента трансплантата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мембранный массив на 600 точек имеет размеры ~7 см x 13 см. После синтеза матрицы могут храниться при комнатной температуре в виде сухих мембран не менее двух лет при экранировании от прямого света. Избегайте чрезмерного складывания мембраны, чтобы сохранить ее долговечность при многократном использовании.
- Регидратируйте мембранный массив этанолом и визуализируйте пептидные пятна, окрашенные Ponceau S.
- Регидратируйте мембранную решетку, несущую пептиды, после поэтапной процедуры, оптимизированной в Li et al.
- Погрузите мембрану матрицы в 20 мл 100% этанола.
- Добавьте 20 мл дистиллированной воды, чтобы разбавить раствор до 50% этанола и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Измените погружной раствор на 40 мл 100% воды три раза и каждый раз инкубируйте 15 минут.
- Промойте в подходящем рабочем буфере, например, 20 мл TBST (Трис-буферизованный физиологический раствор с 0,1%), три раза в течение 5 минут каждый.
- Окрашивание матрицы по Понсо S для визуализации синтетических пептидов
- Добавьте 20 мл предварительно разработанного раствора Ponceau S непосредственно в гидратированную матрицу и инкубируйте в течение ~30 с с встряхиванием.
- Непрерывно проведите дистиллированной водой по мембране, чтобы удалить пятна цвета фона Ponceau S. Во время этого процесса могут стать заметны пептидные пятна красного цвета.
- Отделите части массива для каждого донора, аккуратно разрезая между участками массива для отдельных случаев. Отметьте ориентацию каждого массива.
- Массив предварительных блоков.
- Заблокируйте мембрану в 20 мл 5% обезжиренного молока, растворенного в буфере TBST. Этот раствор на молочной основе еще больше удалит пятна от цвета Ponceau S. Замените молочный буфер несколько раз, чтобы получить наиболее четкие пептидные изображения.
- Для ведения учета сфотографируйте изображение массива Ponceau S с помощью ручной камеры (пример на рисунке 1).
- Продолжайте блокирование мембраны в 5% обезжиренном молоке при температуре 4 °C в течение ночи или при комнатной температуре в течение 2 часов с покачиванием.
- Инкубируйте массив с антисывороткой для трансплантации.
заметка: Следует отметить, что явление, известное как прозон или эффект Хука, может быть результатом комплемент-зависимой интерференции при анализе сывороточных антител. Чтобы обойти эту проблему, можно рассмотреть возможность проведения дополнительной стадии предварительной обработки сыворотки либо этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), либо тепловой инактивацией образцов сыворотки.
- Снимите блокирующий буфер и промойте мембрану 20 мл TBST три раза на следующий день в течение 5 минут каждый раз.
- Добавьте 20 мкл сырой сыворотки реципиента к 20 мл 2,5% молока в буфере TBST и инкубируйте с мембраной в течение 2-3 ч при комнатной температуре. Обратите внимание, что в этом начальном раунде зондирования рекомендуется сначала использовать последнюю сыворотку после трансплантации (или, вероятно, наиболее сенсибилизированную сыворотку) во временном ряду. Это основано на предположении, что более ранние образцы в этой серии, особенно из периодов до трансплантации, имеют меньшее разнообразие аллоантител, которые имеют тенденцию развиваться с течением времени. Таким образом, любая возможность интерференции сигнала от «переноса» между зондирующими раундами может быть четко отделена от действительно развитой реактивности аллоантител из-за иммунных реакций против трансплантата.
- Промойте матрицу, используя 20 мл TBST и инкубируйте его со вторичным антителом.
- Промойте мембрану три раза по 10 минут каждый раз.
- Инкубировать с козьим вторичным антителом против человека IgG-HRP (пероксидаза хрена) в соотношении 1:10 000 в буфере TBST с добавлением 1% молока в течение еще 2 ч.
- Промойте и проявите кляксу.
- Каждый раз трижды промойте мембрану с TBST в течение 10 минут.
- Проведите усиленную хемилюминесценцию (ЭКЛ) с использованием 5 мл раствора люминола, только что смешанного с 5 мл раствора перекиси, для проявления мембраны (в течение 1 мин).
- Визуализируйте сигналы ECL с помощью подходящего имидж-сканера (например, ChemiDoc Imaging Systems или Azure C600).
- Отсканируйте и количественно оцените блот.
- Сохраните полученные изображения (Рисунок 2, нижнее изображение) и выполните количественную оценку интенсивности пятна.
3. Сравните реактивность антисыворотки в клиническом временном ряду.
- Удалите массив.
- На этом этапе всегда держите мембрану влажной.
- Снимите мембрану путем инкубации с 20 мл коммерческого буфера для снятия изоляции при 37 °C в течение 20 минут, а затем промойте мембрану TBST три раза по 10 минут каждый. Затем повторите шаги блокировки (шаг 3.2) и зондирования (шаг 3.3) с использованием другой сыворотки пациента, взятой в другой момент времени.
- Блокируйте зачищенную мембрану.
Примечание: После удаления мембрана может быть повторно использована для еще одного раунда зондирования другой сыворотки от того же пациента во временном ряду.
- Заблокируйте мембрану с помощью 5% молочного буфера, как и раньше (см. шаг 2.2).
- Повторите исследование другой антисыворотки из того же временного ряда (повторите шаги с 2,3-2,6; пример на рисунке 2, верхнее изображение).
заметка: Затем очищенная матрица может быть использована для повторного исследования другого образца сыворотки. Поскольку пептиды ковалентно конъюгированы с поддерживающей матрицей мембраны, мы показали, что матрица может быть повторно использована до 20 циклов стриппинга и повторного зондирования без потери ее производительности.
