Обнаружение циркулирующих антигликановых антител с помощью печатной гликановой матрицы

Аннотация

Источник: Olivera-Ardid, S. et al., Печатный гликановый массив: чувствительная техника для анализа репертуара циркулирующих антиуглеводных антител у мелких животных.J. Vis. Exp.(2019)

Это видео демонстрирует технологию печатной гликановой матрицы для анализа циркулирующих антигликановых антител в сыворотке мыши. Антитела в сыворотке взаимодействуют со специфическими гликанами на чипе, что подтверждается иммуноокрашиванием с последующим флуоресцентным сканированием.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Производство гликочипов

1. Подготовка микрочипов
   1. Напечатайте гликаны (50 мМ) и полисахариды (10 мкг/мл) в 300 мМ фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 8,5) с 6 повторениями на предметных стеклах, N-гидроксисукцинимид, используя бесконтактный роботизированный матриер (объем капель ~900 пл). Каждый слайд содержит 4 различных блока подмассивов (Рисунок 1A, в цветах), повторяющихся 6 раз. Каждый отдельный подмассив образован 112 различными гликановыми пятнами, включая контрольные (8 строк × 14 столбцов) (рис. 1B).
      заметка: Информация, связанная с гликанами, представлена в таблице 1. Библиотека гликанов, используемая для печати микрочипов, является результатом многолетних синтетических усилий команды IBCh; Примеры синтеза описаны в соответствующих публикациях. Библиотека гликанов включала антигены группы крови и некоторые из наиболее часто встречающихся терминальных олигосахаридов, а также основные мотивы N- и O-связанных гликопротеинов и гликолипидов млекопитающих, опухолеассоциированных углеводных антигенов и полисахаридов патогенных бактерий.
   2. Инкубируйте предметные стекла в ящике для влажности (относительная влажность ~70%) при комнатной температуре (25 °C) в течение 1 часа.
   3. Блокирующие микрочипы: инкубировать предметные стекла в течение 1,5 ч с блокирующим буфером при комнатной температуре (100 мМ борной кислоты, 25 мМ этаноламина, 0,2% (v/v) Tween-20 в ультрачистой воде).
   4. Промойте гликочип сверхчистой водой и высушите его на воздухе.
2. Контроль качества гликочипа
   1. Проанализируйте два микрочипа из каждой партии с использованием 1 мг/мл раствора комплексного препарата иммуноглобулина (CIP, содержащего иммуноглобулины: IgG, IgM и IgA), 10 мкг/мл раствора биотинилированных козьих античеловеческих иммуноглобулинов в качестве вторичного антитела (IgM + IgG + IgA), а затем 1 мкг/мл раствора соответствующего флуоресцентного конъюгата стрептавидина (по протоколу, описанному ниже, см. шаг 2).
   2. Отсканируйте и проанализируйте гликочипы (см. шаг 3, анализ гликановой матрицы).
   3. Используйте партии микрочипов с внутри- и межчиповой корреляцией выше 0,9.

2. Метод гликановой матрицы

1. Приготовьте следующие водные растворы (в сверхчистой воде) и храните их при комнатной температуре (25 °C):
   1. Буфер-1: 1% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA) в фосфат-солевом буфере (PBS), 1% (v/v) Tween-20 и 0,01% (w/v) азида натрия (NaN₃).
   2. Буфер-2: 1% (w/v) BSA в PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 и 0,01% (w/v) NaN₃.
   3. Буфер-3: 0,1% (v/v) Tween-20 в PBS.
   4. Буфер-4: 0,001% (v/v) Tween-20 в PBS.
2. Гликочип и пробоподготовка
   1. Поставьте ящик для хранения с предметными стеклами на стол до тех пор, пока они не нагреются до комнатной температуры (25 °C).
      заметка: Используйте неопудренные латексные перчатки. Управление гликочипом необходимо осуществлять с помощью нижней части предметного стекла, где находится штрих-код. Штрих-код поможет вам определить правильную сторону, избегая контакта с поверхностью, на которую напечатаны гликаны.
   2. Откройте коробку, возьмите гликочип и поместите его в инкубационную камеру (25 °C), уже скондиционированную влажной фильтровальной бумагой для поддержания постоянной влажности внутри камеры.
   3. Тем временем разведите сыворотку мышей с Buffer-1 (1:20) в пробирках объемом 1,5 мл. Гомогенизируйте раствор сыворотки (5 с) с помощью вихревого смесителя. <бр/> заметка: Объем, необходимый для полного покрытия одной поверхности гликочипа, составляет примерно 1 мл.
   4. После гомогенизации разведенную сыворотку инкубировать при 37 °C в течение 10 минут на водяной бане, чтобы избежать агрегации иммуноглобулинов. Центрифугируйте пробирки в течение 3 минут при 10 000 x g и 25 °C, соберите надосадочную жидкость и выбросьте выпавший в осадок материал.
   5. Осторожно поместите гликочип в инкубационную камеру. Инкубируйте его в течение 15 минут при 25 °C с 1 мл Buffer-3, чтобы удалить остатки материала на поверхности гликочипа.
   6. Держите гликочип в вертикальном положении и повторно промойте его несколькими каплями Buffer-3 с помощью пластиковой пипетки Пастера. Осторожно удалите буфер с поверхности гликочипа с помощью фильтровальной бумаги.

3. Реакция: связывание антител

1. Поместите гликочип в инкубационную камеру. Распределите разведенный образец сыворотки по поверхности гликочипа с помощью микропипетки. Инкубировать с орбитальным перемешиванием (30 об/мин) при 37 °C в течение 1,5 ч. Убедитесь, что вся сухая область поверхности гликочипа покрыта разбавленным образцом сыворотки с помощью кончика пипетки.
2. Удалите лишний образец и погрузите гликочип на 5 минут в буфер-3 при температуре 25 °C. Затем переместите гликочип в емкость с Буфером-4 (5 мин) и, наконец, промойте (5 мин) гликочип сверхчистой водой. Центрифугируйте гликочип в течение 1 минуты при 175 x g и 25 °C, чтобы удалить жидкость.

4. Обнаружение: вторичное антитело

1. Поместите гликочип в инкубационную камеру. Распределите по поверхности гликочипа раствор (5 мкг/мл) козьего антимышиного препарата (IgG + IgM), конъюгированного с биотином в буфере-2. Инкубировать с орбитальным перемешиванием (30 об/мин) при 37 °C в течение 1 ч.
2. Удалите несвязанную фракцию и повторите шаги промывки.
3. После центрифугирования гликочип инкубируют в темноте при 25 °C в течение 45 мин (30 об/мин) с 2 мкг/мл соответствующего раствора стрептавидина, меченного флуорохромом (в буфере-2).
4. В темноте удалите несвязанную фракцию и повторите шаги стирки.
5. Высушите гликочип на воздухе. <бр/> заметка: Гликочип должен быть отсканирован как можно скорее. Но если сразу после окрашивания сделать сканирование невозможно, гликочипы можно хранить в прохладном и сухом месте в темноте.

3. Анализ гликановой матрицы

1. Сканирование массива
   1. Оставьте гликочип на столе до тех пор, пока он не достигнет комнатной температуры в темноте. Одновременно включите сканер слайдов и лазер (длина волны возбуждения 633 нм).
   2. Удерживая микрочип, вставьте гликочип в паз до тех пор, пока он не коснется задней панели.
   3. Отсканируйте гликочип («run easy scan») и сохраните сканирование как ». TIFF".

Таблица 1: Список гликанов, их связывание с естественными циркулирующими антителами (IgM + IgG) мышей BALB/c (n = 20), выраженных в единицах относительной флуоресценции (RFU) как медиана ± MAD, и количество животных, превышающее отсечку (≥4000 RFU). Эта таблица была воспроизведена из Bello-Gil, D. et al. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение (не в масштабе) конфигурации, печати и анализа гликановой матрицы.(А) Напечатанные микрочипы разрабатываются с использованием библиотеки из 419 различных гликановых структур с последующим детектированием с помощью соответствующего флуоресцентно меченного вторичного антитела. Каждый слайд содержит 4 различных блока подмассивов (в цветах), повторяющ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антитела
Биотинилированный козий античеловеческий Igs	Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	Номер #: 31782
Биотинилированный козий антимышиный IgM + IgG	Thermo Fisher Scientific	Номер #: 31807
оборудование
Роботизированный массив sciFLEXARRAYER S5	Scienion AG, Берлин, Германия	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Лоток для морилки (инкубационная камера с шифером)	Simport, Beloeil, QC, Канада	Ссылка #: M920-2
центрифуга	Eppendorf, Гамбург, Германия	Код #: 5810 R
Пипетки	Гилсон, Миддлтон, штат Висконсин, США	http://www.gilson.com/en/Pipette/
Сканер слайдов	ПеркинЭлмер, Уолтем, Массачусетс, США	ScanArray GX Plus
Встряхивающий инкубатор	Коул-Пармер, Стаффордшир, Великобритания	Ссылка #: SI50
Биологические образцы
BALB/c мышиная сыворотка	Этот документ	Н/ Д
Комплексный препарат иммуноглобулина (CIP)	Иммуно-Джем, Москва, Россия	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Химикаты, реактивы и гликаны
Библиотека гликана	Институт биоорганической химии (ИБХ), Москва, Россия	Н/ Д
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури,	Номер #: A9418
Этаноламин	Сигма-Олдрич	Номер #: 411000
Подросток-20	Merck Chemicals & Life Science S.A., Мадрид, Испания	Ссылка #: 655204
Фоспате-буферный физиологический раствор (PBS)	VWR International Eurolab S.L, Барселона, Испания	Ссылка #: E404
Азид натрия	Сигма-Олдрич	Ссылка #: S2002
Стрептавидин Alexa Fluor 555 конъюгат	Thermo Fisher Scientific	Номер #: S21381
Стрептавидин Cy5 конъюгат	GE Healthcare, Литтл-Чалфонт, Бакингемшир, Великобритания	Ссылка #: PA45001
материалы
N-гидроксисукцинимид-производные стеклянные стекла H	Schott-Nexterion, Йена, Германия	Ссылка #: 1070936
Фильтровальная бумага ватман	Сигма-Олдрич	Ссылка #: WHA10347509
Пробирки объемом 1,5 мл	Эппендорф	Ссылка #: 0030120086
Программное обеспечение и алгоритмы
Система анализа микрочипов ScanArray Express	ПеркинЭлмер	http://www.per< чел. /> kinelmer.com/microarray