$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Проектирование слайда массива и компоновки исходной пластины
- Под заголовком «Планирование макета слайдов» в интерфейсе ArrayNinja нажмите на ссылку, соответствующую используемому принтеру микрочипов.
заметка: ArrayNinja был запрограммирован на имитацию роботизированных движений двух широко используемых микрочиповых принтеров (см. Таблицу 1). Совместимость с другими массивами может быть сконфигурирована по запросу.
- Нажмите в диалоговом окне "Загрузить пластину", введите "empty" и нажмите "enter". На рисунке 1 показан скриншот модуля проектирования ArrayNinja.
- Отрегулируйте диаметр пятна до 275 мкм и расстояние между пятнами до 375 мкм. Отрегулируйте остальные параметры (Блоки пластин/ряд пластин, Общее количество рядов пластин, реплики, объекты в y, Супермассивы, Помадка SuperA; см. рис. 1), чтобы настроить то, как элементы будут отображаться на слайде микрочипа.
заметка: Диаметр пятна определяется размером контакта микрочипа. По мере корректировки этих настроек слайд мультфильма будет обновляться в режиме реального времени. Используйте этот мультфильм для предварительного просмотра того, как каждый параметр изменяет окончательный макет слайда.
- После того, как компоновка объектов на слайде будет завершена, наведите курсор мыши на каждый уникальный объект и введите идентификатор объекта во всплывающем диалоговом окне.
заметка: Идентификаторы функций могут состоять из цифр, букв или комбинаций. Это требуется только для уникальных объектов, и диалоговое окно не будет отображаться при выборе реплик.
- После того, как всем уникальным элементам присвоен идентификатор, нажмите «заполнить». Введите название макета слайда и нажмите «Распечатать номер», чтобы сохранить. Откроется новая страница, отображающая количество 384-луночных исходных пластин, необходимых для изготовления выбранной конструкции слайда, и таблица, отображающая физическое расположение каждого элемента, который должен быть загружен в исходную пластину (пластины).
заметка: Запомните это название, так как оно будет использоваться для напоминания об этой конструкции при анализе данных микрочипов. Нажатие кнопки «Распечатать пластину» сохраняет макет в ArrayNinja.
2. Изготовление микрочипов
- Подготовка исходной пластины
- Используйте карту, сгенерированную с помощью ArrayNinja, для создания 384-луночных исходных пластин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные описания пептидов, запрашиваемых на этой платформе, можно найти в других источниках.
- Внесите 1 - 2 мкл каждой особенности (например, биотинилированный гистоновый пептид) в соответствующую лунку 384-луночной исходной пластины(-ов).
заметка: Биотинилированные гистоновые пептиды обычно осаждаются из 200 - 400 мкМ стоковых растворов, что соответствует 10-25-кратному молярному избытку пептида к сайтам связывания стрептавидина в одном матричном пятне. Это вычисляется с использованием уравнения:
где V — объем, выдаваемый булавкой, [P] — концентрация печатаемого объекта, NA — число Авогадро, а S — площадь поверхности пятна. C — покрытие предметного стекла, выраженное как количество молекул стрептавидина на единицу площади, умноженное на три (среднее число доступных сайтов связывания стрептавидина). V и C получены соответствующим производителем. Другие особенности могут требовать различных концентраций в зависимости от размера биомолекулы, где скученность может быть проблемой. Диапазон концентраций печати для каждого нового типа элемента должен быть проверен опытным путем, чтобы определить оптимальную концентрацию печати.
- Разбавьте каждый признак в 10 раз с помощью 1x печатного буфера с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Вращайте исходную пластину (пластины) при давлении 500 x g в течение 2 минут при комнатной температуре.
заметка: Включение меченного флуоресцеином биотина (5 мкг/мкл) в печатающий буфер рекомендуется в качестве средства контроля пятнистости и в качестве визуального пособия для облегчения правильного выравнивания матрицы во время анализа (см. рис. 3).
- Протокол печати (Рисунок 2А – Б).
- Подготовьте устройство для сбора отходов, опорожнив контейнер для сбора отходов и наполнив контейнер для моющего раствора и контейнер для увлажнителя стерильной дистиллированной водой.
- Введите параметры, используемые для проектирования слайда в ArrayNinja (рисунок 1), в программу управления принтером микрочипа.
- С помощью программы управления принтером на микрочипе задайте процедуру промывки за 1 секунду с одним погружением. Установите настройки после стирки, чтобы повторно окунать штифты 5 раз после каждой стирки. Установите влажность на 60%.
заметка: Оптимальная конфигурация промывки может варьироваться в зависимости от используемого принтера с микрочипами. Оптимальная конфигурация погружения штифтов после промывки может варьироваться в зависимости от используемого принтера с микрочипами.
- Вставьте функционализированные предметные стекла (например, стекло с покрытием стрептавидином) в подложку и поместите все плиты в элеватор подложки. Вставьте исходную пластину (пластины) в держатель (держатели) пластины и поместите в элеватор исходной пластины.
- Нажмите «Печать». Контролируйте процесс печати в течение нескольких раундов нанесения элементов, чтобы убедиться, что все настройки промывки и погружения правильные. Когда тираж будет завершен, снимите подложку с устройства для монтажа.
заметка: Если большие тиражи не позволяют выполнить этапы блокировки в течение одного дня, напечатанные слайды можно инкубировать в увлажненной камере при температуре 4 °C в течение ночи. Инкубируйте горки рядом с небольшим стаканом с водой внутри картонной коробки, запечатанной полиэтиленовой пленкой.
- Заблокируйте предметные стекла блокирующим буфером на 30 минут при комнатной температуре с перемешиванием.
- Промыть предметные стекла 2 х 10 мин при комнатной температуре в фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,6 при перемешивании. Высушите предметные стекла, вращая в микрочиповой центрифуге для слайдов в течение 30 с при комнатной температуре.
заметка: Для одновременной обработки большого количества предметных стекол можно использовать высокопроизводительную камеру для промывки предметных стекол микроскопа, позволяющую параллельно промывать 50 предметных стекол.
- Для слайдов, предназначенных для разделения с помощью воска, перейдите к разделу 2.1. Для всех остальных конструкций предметные стекла следует хранить при температуре 4 °C в защищенном от света и влаги месте><.
заметка: Напечатанные биотинилированные гистоновые пептиды стабильны в течение как минимум 6 месяцев при хранении таким образом.
2. Разбиение слайдов микрочипов
- Гидрофобная восковая ручка (Рисунок 2C)
- Нанесите воск вокруг областей, содержащих особенности, с помощью воскового карандаша. Дайте воску высохнуть на воздухе в течение 5 минут, прежде чем приступать к разделу 3.
заметка: После блокировки пятна массива может быть очень трудно визуализировать на глаз. Дизайн слайда от ArrayNinja можно распечатать в масштабе и использовать в качестве руководства для нанесения воска.
- Силиконовая прокладка (Рисунок 2D)
- Снимите прозрачную пленку с обратной стороны прокладки матрицы и положите клейкой стороной вниз на предметное стекло микрочипа.
- Удерживайте прокладку на месте в течение 5 секунд, прежде чем переходить к разделу 3.
- Восковой отпечаток (Рисунок 2E)
- Для слайдов, предназначенных для разделения воском, напечатайте тестовое стекло на обычном стекле с использованием 10% BSA. Используйте этот тестовый слайд для оптимизации направляющих воскового импринтера или настроек массива, чтобы убедиться, что все элементы будут находиться в камерах восковой формы.
- Нагрейте восковой принтер микрочипа до 85 °C до полного расплавления всего воска, примерно 30 минут.
- Вставьте предметное стекло печатной стороной вниз и нажмите на предметное стекло до упора до правой направляющей на импринтере микрочипа. Потяните вверх рычаг, чтобы форма соприкоснулась с поверхностью предметного стекла. Держите 2 с.<бр/>
заметка: Время удержания может быть изменено для достижения оптимальной толщины восковой каймы.
- Быстро снимите предметное стекло и визуально осмотрите восковые бордюры, чтобы убедиться, что все лунки закрыты и что бордюры не настолько толстые, чтобы они посягали на пятна. Хранить предметные стекла при температуре 4 °C в защищенном от влаги и света месте><.
заметка: Время удержания может быть увеличено или уменьшено для получения более толстых или тонких границ.
3. Гибридизация антитела к гистону PTM с пептидным микрочипом
- Приготовьте буфер для гибридизации (PBS, pH 7,6, 5% BSA, 0,1% Tween-20).
- Уравновесьте предметное стекло в буфере для гибридизации с помощью гибридизационного сосуда. Полностью закройте все предметное стекло в буфере для гибридизации и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 4 °C на орбитальном вибростенде на низкой скорости.
- Приготовьте раствор, содержащий разведенное антитело к гистону PTM в буфере для гибридизации.
заметка: В данных примера оба антитела к гистонам #1 и антитела #2 были разведены в соотношении 1:1000 в буфере для гибридизации. В качестве отправной точки рекомендуется использовать диапазон разведения, аналогичный тому, который используется для иммуноблоттинга.
- Инкубируйте матрицу с раствором антитела в течение 1 ч при 4 °С. Удалите раствор антитела и промойте матрицу 3 раза в течение 5 мин при 4 °С холодным PBS, рН 7,6.
- Приготовьте разведение в соотношении 1:5000 - 1:1000 флуоресцентного конъюгированного красителем вторичного антитела в буфере для гибридизации.
- Инкубируйте матрицу с раствором вторичного антитела в течение 30 мин при 4 °C в защищенном от света месте. Удалите вторичный раствор антитела и промойте предметное стекло микрочипа 3 раза в течение 5 мин при 4 °C с PBS, pH 7,6. Опустите микрочип в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 0,1x PBS, pH 7,6 для удаления избытка соли при комнатной температуре. Высушите предметное стекло в микрочиповой центрифуге для предметных стекол при комнатной температуре.
- Отсканируйте предметное стекло с помощью микрочипового сканера с разрешением 25 μм или выше, следуя протоколу сканирования, рекомендованному производителем микрочипа.
заметка: Если присутствует метеный флуоресцеином индикатор биотина, просканируйте как зеленый канал (например, 488 нм, em: 509 нм), так и канал, соответствующий флуоресцентному вторичному антителу, конъюгированному с красителем, обычно красного цвета (например: 635 нм, em: 677 нм). Целью сканирования является получение одноканальных .tif файлов, которые могут быть объединены в один файл .png.
