Анализ поглощения антител для визуализации Notch/DeltaD сигнализации у предшественников радиальной глии рыбок данио

Аннотация

Источник: Zhao, X. et al., Анализ поглощения антител для отслеживания Notch/дельта-эндоцитоза во время асимметричного деления предшественников радиальной глии данио-рерио.J. Vis. Exp. (2023)

Это видео демонстрирует анализ поглощения антител для изображения передачи сигналов Notch/DeltaD у предшественников радиальной глии данио-рерио. Он включает в себя сборку дехорионированных эмбрионов данио-рерио, встроенных в агарозу, введение раствора красителя, нацеленного на DeltaD-лиганды на RGP, и визуализацию под флуоресцентным микроскопом для асимметричного деления клеток, подтверждающего активацию передачи сигналов Notch/DeltaD.

Протокол

1. Подготовка эмбрионов рыбок данио

1. Установите аквариумы для пересечения рыб во второй половине дня до 17:00 с одной самкой дикой рыбы и одним самцом рыбы Tg [ef1a:Myr-Tdtomato], используя разделители для их разделения в каждом аквариуме.
2. На следующее утро уберите разделители до 11:00 со всех цистерн для переезда. Ведите себя тихо и не беспокойте рыб во время их спаривания. Нерест обычно происходит в течение 30 минут после удаления разделителей. Оплодотворенные яйца остаются на дне резервуара.
   1. Соберите оплодотворенные яйца из емкостей с помощью сетчатого фильтра. Перенесите яйца, смыв их, в чашку Петри, наполненную яичной водой, и исследуйте эмбрионы под микроскопом при 10-20-кратном увеличении.
3. Перенесите оплодотворенные эмбрионы в чистый петридиш, содержащий примерно 20 мл эмбриональной среды (100 мл 1000-кратного стокового раствора содержит 29,4 г хлорида натрия (NaCl), 1,27 г хлорида калия (KCl), 4,85 г хлорида кальция, дигидрата (CaCl_{2,2H 2}O) и 8,13 г гептагидрата сульфата магния (MgSO_{4,7H 2}O)) со стеклянными пипетками Пастера с большим диаметром ствола. Хранить эмбрионы при температуре 28 °C. Хранить 50 оплодотворенных эмбрионов в чашке Петри с 30 мл среды для эмбрионов при температуре 28,5 °C.
   Примечание: Одна пара рыб обычно производит 100-300 эмбрионов, а оплодотворение и выживаемость здоровых эмбрионов составляет более 95% при каждом спаривании.
4. На следующее утро выньте эмбрионы из инкубатора в 8:00 утра, когда эмбрионы достигнут стадии развития ~18-20 ч после оплодотворения (HPF). Наблюдайте за ними под эпифлуоресцентным микроскопом при 20-кратном увеличении, сначала используя белый свет. В это время эмбрионы данио-рерио находятся на стадии 20-сомита.
   1. Отбракуйте мертвые эмбрионы, которые помутнели или разорвались под микроскопом с помощью стеклянной пипетки.
5. Включите люминесцентную лампу и выберите настройку фильтра красного флуоресцентного белка (RFP) микроскопа. Затем выберите эмбрионы с сильной красной флуоресценцией и перенесите их в новую посуду с яичной водой.
   1. Дехорионировать эмбрионы вручную с помощью двух тонких щипцов (кончики щипцов должны быть острыми и неповрежденными) под белым светом (Таблица материалов).
   2. Удерживайте хорион одной парой щипцов и сделайте разрыв в хорионе другими щипцами. Осторожно откройте разрыв с помощью щипцов и сделайте его достаточно большим, чтобы эмбрион мог пройти, осторожно проталкивая эмбрион кончиками других щипцов.
6. Перенесите дехорионированные эмбрионы в новую чашку Петри со свежей эмбриональной средой для быстрого промывания перед микроинъекцией.

2. Подготовка микроинъекции

1. Используйте капилляры (внешний диаметр 1,2 мм (OD), внутренний диаметр (ID) 0,9 мм, с нитью) для протягивания тонких инъекционных игл на пуллере. Разработайте и оптимизируйте программу вытягивания в соответствии с руководством.
2. Вскройте кончик иглы щипцами под стереодиссекционным микроскопом. Сделайте диаметр наконечника около 10 мкм, а угол конуса около 30°.
3. Перед инъекцией конъюгируйте мышиное моноклональное антитело против Dld с антимышиным IgG-Atto647N.
   1. Для каждого эксперимента по инъекции смешивают 0,5 мкл антитела против Dld (0,5 мг/мл) с 2 мкл антитела против мышиного IgG-Atto647N (1 мг/мл) путем пипетирования 5-10 раз. Затем инкубируйте при комнатной температуре не менее 30 минут (или на льду в течение 2-3 часов).
   2. После инкубации добавьте 2,5 мкл блокирующего буфера (10 мг/мл мышиного IgG) и 0,5 мкл 0,5% фенолового красного в смесь антител и пипеткой 10 раз тщательно перемешайте, чтобы блокировать любые неконъюгированные антитела><, оставшиеся в смеси. заметка: Для каждого испытания приготовьте одну дополнительную смесь без антител против Dld и используйте ее в качестве контроля.
4. Приготовьте 1%-ную агарозу с низкой температурой плавления в зародышевой среде. Нагрейте смесь, содержащую агарозу, до 70 °C до тех пор, пока смесь не станет прозрачной.
   1. Разложите раствор агарозы в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл. Держите аликвоты в нагревательном блоке при температуре ~40 °C.
5. Промойте эмбрион в пробирке, содержащей 1% агарозу с низкой температурой плавления, в течение 3 с.
6. Поместите эмбрион на перевернутую пластиковую крышку чашки Петри вместе с отдельными каплями агарозы (~30-40 μл), чтобы закрепить каждый эмбрион отдельно на крышке, как показано на рисунке 1. Положите эмбрионы в агарозу плашмя сбоку и сохраняйте это положение до тех пор, пока агароза не затвердеет при комнатной температуре.
7. Посадите 12 эмбрионов в три ряда по одному, как показано выше. Накройте все смонтированные зародыши в агарозе яичной средой.

3. Микровпрыск

1. Поместите внедренные эмбрионы под стереомикроскоп и залейте агарозу яичной водой.
2. Установите инжектор давления воздуха вместе с микроманипуляторами, расположив их близко к микроскопам, как показано на рисунке 1. В качестве источника воздуха используйте стальной газовый баллон, содержащий газообразный азот (N₂) под высоким давлением.
   1. Открывайте газовый клапан только после того, как эмбрионы были установлены в агарозу. Затем спереди загрузите подготовленную стеклянную иглу с 2 мкл смеси антител на микроманипулятор, как показано на рисунке 1, при использовании модуля фронтального заполнения микроинжектора.
   2. Настройте входное давление на ~80-90 фунтов на квадратный дюйм, а давление впрыска на ~20 фунтов на квадратный дюйм.
3. Откалибруйте объем инъекции с помощью микрометра под микроскопом, как описано ранее. Установите продолжительность времени настройки от 10 мс до 120 мс, в зависимости от размера отверстия иглы. Подавайте каждый импульс инъекции, постукивая по лопатке. Отрегулируйте объем впрыска при каждой подаче на ~4-5 нл.
4. Проткните кончик иглы для микроинъекций через дорсальную пластину крыши заднего мозга позади точки шарнира r0/r1 и введите около 10 нл (два или три импульса) смеси антител, не затрагивая ткани мозга. Наблюдайте за потоком красных жидкостей в желудочке головного мозга.
   заметка: Желудочек заднего мозга находится позади границы заднего мозга среднего мозга. Введенная смесь антител, содержащих фенол красный, немедленно заполняет желудочек головного мозга от заднего мозга до переднего мозга путем диффузии спинномозговой жидкостью.
5. После инъекции быстро извлеките кончик иглы из эмбриона, вращая ручку микроманипулятора. Для успешной инъекции красный краситель введенной смеси стабильно остается в желудочке мозга, не просачиваясь в окруженный агароз.
6. Переместите монтажную пластину под микроскоп, чтобы найти еще один установленный эмбрион в подходящем положении для повторов.
   1. После введения шести-восьми эмбрионов очистите агарозу микрохирургическим ножом, чтобы освободить эмбрионы от внедренной агарозы. Перенесите микроинъекционные эмбрионы в свежую чашку с 30 мл эмбриональной среды и поместите их при комнатной температуре для следующих шагов.

4. Монтаж и покадровая съемка в реальном времени

1. Через 30 мин перенесите выбранные эмбрионы в 10 мл эмбриональной среды. Добавьте 420 мкл трикаина (4 мг/мл) в 10 мл эмбриональной среды для обезболивания эмбрионов.
2. Для посадки эмбрионов приготовьте агарозу с низкой температурой плавления 0,8%, содержащую в пробирке такую же концентрацию трикаина. Держите аликвоты в нагревательном блоке при температуре ~40 °C.
3. С помощью стеклянной пипетки погрузите введенные эмбрионы в теплую агарозу на 3 с. Затем сразу же извлеките зародыши из агарозы с помощью той же стеклянной пипетки и поместите зародыши на центр 35 мм стеклянного дна чашки для культуры с каплей агарозы из пробирки. Помещайте на стекло только один эмбрион на каплю.
4. Осторожно ориентируйте эмбрионы с помощью волоконного зонда или загрузочного наконечника, чтобы дорсальная сторона мозга эмбриона была как можно ближе к стеклянному дну. Аккуратно отрегулируйте положение эмбриона, чтобы продлить зародыш без скручивания, пока агароза постепенно затвердевает.
5. После этого проверьте положение эмбриона, перевернув стеклянную миску с дном. Убедитесь, что весь дорсальный передний мозг с правильно установленными эмбрионами можно увидеть под микроскопом.
6. Добавьте 2-3 мл 28,5 °C предварительно подогретой эмбриональной среды, содержащей трикаин, чтобы покрыть эмбрион. Правильно установите чашку на столик конфокального микроскопа с регулируемой температурой, как показано на рисунке 1. Отрегулируйте температуру камеры визуализации на уровне 28,5 °C. Теперь эмбрион готов к визуализации.

Результаты

Рисунок 1: Блок-схема экспериментальных этапов.Трансгенные данио-рерио, экспрессирующие MyR-Tdtomato reporter, скрещиваются с AB wild-type в 1-й день. На 2-й день отбираются красные флуоресцентные эмбрионы для микроинъекции, после чего проводится покадровая визуализация. Весь эксперимент на^2-й день занимает около 8 часов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чашка для культуры со стеклянным дном 35 мм	Корпорация MatTek	П35ГК-1,5-10-К
Форсунка воздуха под давлением	Нарисигэ	ИМ300
Антимышиный IgG-Atto647N	Сигма-Олдрич	50185
CaCl2.2H2O	Сигма-Олдрич	С3306
Капилляры, внешний диаметр 1,2 мм, внутренний диаметр 0,9 мм, с нитью накала	Мировые прецизионные приборы	1В120Ф-6
CSU-W1 Вращающийся диск / высокоскоростной широкоугольный	Никин	Н/Д	Инвертированный флуоресцентный микроскоп Nikon Ti с большим фокусным полем зрения CSU-W1.
Медицинский пинцет Dumont Style 5	Томас Сайенти	72877-Д
Пуллер Flaming-Brown P897	Инструменты Саттера	Н/Д	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl	Многородность	529552
MgSO4.7H2O	Сигма-Олдрич	М2773
Микроманипуляторы	Мировые прецизионные приборы	ВПИ M3301R
Мышь анти-Dld	Абкам	AB_1268496
Буфер блокировки IgG мыши от Zenon	Thermofisher Scientific	З25008
NaCl	Сигма-Олдрич	С3014
Феноловый красный	Сигма-Олдрич	П0290
STEMI 2000	Цейсс	Н/Д
Трикаин	Сигма-Олдрич	Е10521
UltraPureTM с низкой температурой плавления агароза	Инвитроген	16520050

диск