1. Иммунолокализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура флуоресцентной иммунолокализации основана на последовательном использовании двух антител. Первичное антитело вырабатывается против определенного антигена-мишени. Вторичное антитело поднимается специфически против первичного антитела и для флуоресцентных методов конъюгируется с флуорофором (FITC [флуоресцеин изотиоцианат] в этом конкретном протоколе). Первичное антитело будет использоваться для обнаружения целевого антигена в образце, а вторичное антитело будет использоваться для обозначения места, где первичное антитело соединилось с образцом после смывания избытка первичного антитела. Контроль является важной частью этого анализа и всегда должен проводиться для обеспечения точности наблюдений. Одна лунка на предметном стекле должна быть зарезервирована для использования в качестве отрицательного контроля, где лечение первичными антителами будет пропущено, и поэтому в конце эксперимента не должно наблюдаться никакого сигнала. Положительный контроль должен быть включен в эксперимент путем обработки пациента антителом, маркировка которого уже известна и определена. Положительный контроль используется для подтверждения эффективности мечения вторичных антител и условий реакции, в то время как отрицательный контроль проверяет специфичность вторичных антител.
- Подготовьте инкубационную камеру, положив несколько влажных бумажных полотенец на дно коробки с наконечниками для пипеток и обернув ее оловянной фольгой (рис. 1B-1E). Поместите предметные стекла в инкубационную камеру.
- Пипеткой капля 50 мкл на лунку 8 мм блокирующего раствора (5% обезжиренного сухого молока (w/v) в 1 М фосфатно-солевого буфера [PBS]) и инкубируйте в течение 10 мин. Удалите блокирующий раствор и дважды промойте все лунки PBS в течение 10 мин.
- Приготовьте первичные растворы антител (см. таблицу 1), антитела 1:5 (v/v) в блокирующем растворе; оцените около 40 μL на 8 мм лунку.
заметка: Концентрация антитела должна быть скорректирована в соответствии с протоколом производителя.
- Выполните окончательную промывку водой двойной дистилляции (ddH2O) в течение 5 минут, никогда не допускайте полного высыхания лунок.
- Пипеткой введите первичный раствор антитела в реакционные лунки. Раствор для блокировки пипеток в контрольных лунках.
- Закройте инкубационную камеру и дайте постоять 2 ч при комнатной температуре, а затем в течение ночи при 4 °C. Приготовьте вторичный раствор антитела, 1% в блокирующем растворе (v/v) около 40 мкл на лунку. Держите его накрытым оловянной фольгой.
- Дважды промойте все лунки PBS в течение 10 минут, а затем еще 10 минут ddH2O. Убедитесь, что на лунках не видно следов блокирующего раствора или отложений.
- Пипеткой подайте вторичный раствор антитела во все лунки. Отныне защищайте горки от света.
- Выдерживать 3–4 ч в темноте при комнатной температуре.
- Промойте все лунки дважды в течение 10 минут PBS, а затем еще раз промыть 10 минут ddH2O.
- Нанесите каплю калькофтора (1:10 000 (w/v) флуоресцентный ярче 28 в PBS) на каждую лунку. Не промывая, нанесите каплю монтажного средства (см. Таблицу материалов) на каждую лунку и установите покровное стекло (рисунок 2H).
- Наблюдайте с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективами 10x/0,45, 20x/0,75, 40x/0,95 и 100x/1,40, используйте УФ-фильтры (для калькофторного окрашивания) и FITC фильтры для обнаружения клеточной стенки и иммунолокализации соответственно (рис. 2I). Используйте следующие длины волн: возбуждение/излучение (нм) 358/461 для УФ-излучения и 485/530 для FITC.
- Для лучшей визуализации результатов перекрывайте оба изображения с помощью ImageJ или аналогичного.
Таблица 1: Список полезных моноклональных антител. В приведенной выше таблице представлен пример доступных антител с информацией об их мишенях и о том, где их можно приобрести.
| имя | сходство | Доступно по адресу |
| ЛМ2 | Белок арабиногалактан | Plant probes (Лидс, Великобритания) |
| ЛМ5 | Пектины |
| ЛМ6 | Арабинанский |
| ЛМ7 | Гомогалактуронан |
| ЛМ8 | Xylogalacturonan |
| ЛМ13 | (1-5)-а-Л-АРАБИНАН |
| ЛМ14 | Белок арабиногалактан |
| ЛМ16 | Обработанный арабинан - RG-I |
| ЛМ18 | Гомогалактуронан |
| ЛМ19 | Гомогалактуронан |
| ЛМ20 | Гомогалактуронан |
| ЛМ26 | ВЕТВИСТЫЙ-ГАЛАКТАН |
| ЛМ30 | Белок арабиногалактан |
| ДЖИМ5 | Гомагалактуронан с низким содержанием метилэтерифицированного | CCRC (Грузия, США) |
| ДЖИМ7 | Высокометилэтерифицированный гомагалактуронан |
| ДЖИМ4 | Белок арабиногалактан |
| ДЖИМ8 | Белок арабиногалактан |
| ДЖИМ13 | Белок арабиногалактан |
| ДЖИМ15 | Белок арабиногалактан |
| ДЖИМ16 | Белок арабиногалактан |
| ДЖИМ20 | Экстензин |
| МАК207 | Белок арабиногалактан |
