Использование сэндвич-ИФА для определения содержания иммуногенных гликопротеинов в вакцине

Аннотация

Источник: Jallet, C. et al., Тест ИФА in vitro для оценки эффективности вакцины против бешенства.J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует анализ непрямого иммунофермента, сцепленного с иммуноферментами, или анализ иммуноферментного анализа, предназначенный для оценки уровня иммуногенных гликопротеинов в вакцинах. Планшет для анализа, содержащий гликопротеин-специфические антитела, инкубируют с серийно разведенными образцами вакцины, включая референтные и тестовые вакцины, с последующим иммуноанализом для количественного определения содержания гликопротеинов в исследуемой вакцине.

Протокол

1. Меры безопасности

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применим как к живому вирусу бешенства (RABV), так и к инактивированной вакцине.

1. Используйте надлежащую лабораторную практику и процедуры безопасности.
2. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая одноразовый халат, перчатки, маски, очки и т. д.
3. Когда живой вирус титрован, используйте бокс биологической безопасности класса II.
   1. Любой материал, контактирующий с образцами (реагенты, моющие растворы и т.д.), следует рассматривать как инфекционный.
   2. Обработайте загрязненный материал, погрузив его в раствор хлорной извести (2,5% гипохлорита натрия) на 30 мин для обеззараживания.
4. Обращайтесь с химическими веществами в соответствии с надлежащей лабораторной практикой.

2. Подготовка

1. По возможности используйте реагенты аналитического качества.
2. Приготовьте свежие растворы буфера покрытия/карбонатного буфера, буфера пассивации, разбавителя и цитратного буфера (табл. 1), профильтруйте через фильтры 0,45 или 0,22 мкм и храните при температуре 4 °C в течение одного дня перед использованием для сохранения их аналитической чистоты.
3. Дайте реагентам нагреться до комнатной температуры от (+18 °C до +25 °C) за 30 минут до использования и гомогенизируйте путем бережного перемешивания перед использованием.

3. Сенсибилизация микропланшетов

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 96-луночные адсорбционные иммуноферментные планшеты, оптимизированные для связывания большого количества иммуноглобулинов (например, см. Таблицу материалов).

1. В каждую лунку добавляют 200 мкл моноклонального антитела (mAb-D1), разведенного в карбонатном буфере.
   заметка: Экспериментально определена оптимальная концентрация около 1 г/мл, которая соответствует примерно 1/2000 разведению очищенного mAb-D1. Эта рекомендуемая концентрация указана для каждой партии mAb-D1 и должна периодически проверяться положительным контролем.
2. Накройте планшет клейкой пленкой и инкубируйте микропланшет в течение 3 часов при температуре 37 °C во влажной атмосфере.
3. Тщательно отсадите и перенесите содержимое лунки в реципиент, содержащий 2,5% раствор гипохлорита натрия.
4. Переверните микропланшет и дайте ему высохнуть на впитывающей бумаге при комнатной температуре в течение 5 минут.

4. Пассивация микропланшетов

1. В каждую лунку добавьте по 300 мкл пассивационного буфера.
2. Накройте тарелку клейкой пленкой и выдерживайте 30 минут при температуре 37 °C.
3. Тщательно отсадите и переложите содержимое лунки в реципиент, содержащий 2,5% раствор гипохлорита натрия.
4. Переверните микропланшет и дайте ему высохнуть на впитывающей бумаге при комнатной температуре в течение 1 мин. <бр/> заметка: Микропланшет можно использовать сразу или хранить в герметичном виде при температуре -20 °C до 3 месяцев до использования.

5. ИФА анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для установления контрольной кривой референтной вакцины Шаг 5.3 не требуется; для титрования тестируемой вакцины необходимы все Шаги с 5.1 по 5.6.

1. Промывка сенсибилизированной микропластины
   1. В каждую лунку добавьте по 300 мкл промывочного буфера.
   2. Тщательно отсадите и переложите содержимое лунки в реципиент, содержащий 2,5% раствор гипохлорита натрия.
   3. Повторите шаги 5.1.1 и 5.1.2 еще пять раз, чтобы тщательно вымыть сенсибилизированную пластину.
   4. Переверните микропланшет и дайте ему высохнуть на адсорбирующей бумаге при комнатной температуре в течение 1 минуты.
2. Разведения референтной вакцины для контрольной кривой
   1. Восстановите референтную вакцину (валидационный антиген Партия 09) в 1 мл дистиллированной воды, соответствующей концентрации гликопротеина вируса бешенства 10 мкг/мл.
   2. Готовят десятикратное разведение восстановленной референтной вакцины в разбавителе до 1 мкг/мл гликопротеина вируса бешенства.
   3. Приготовьте 6 последовательных двукратных разведений данной референтной вакцины в разбавителе, как указано в таблице 1.
   4. Распределите 200 мкл разбавителя в двух экземплярах (лунки 1H/2H) в качестве контрольной
   единицы.
   5. Распределите по 200 мкл на лунку каждой референтной вакцины в двух экземплярах (лунки от G1/G2 до A1/A2).
3. Разведения тестируемой вакцины для ее титрования
   1. Приготовьте десятикратное разведение тестируемой вакцины в разбавителе.
   2. Приготовьте 7 двукратных серийных разведений испытуемой вакцины в разбавителе, как указано в таблице 2.
   3. Распределите по 200 мкл на лунку каждого испытуемого вакцинного разведения в двух экземплярах (лунки от H3/H4 до A3/A4).
4. Инкубация/промывка планшета ИФА
   1. Накройте микропланшет клейкой пленкой и выдерживайте в течение 1 ч при температуре 37 °C.
   2. Снимите пленку, тщательно отасуньте и перенесите содержимое каждой лунки в реципиент, содержащий 2,5% раствор гипохлорита натрия.
   3. В каждую лунку добавьте по 300 мкл промывочного буфера.
   4. Тщательно отсадите и перенесите содержимое каждой лунки в реципиент, содержащий 2,5% раствор гипохлорита натрия.
   5. Повторите шаги 5.4.3 и 5.4.4 пять раз, чтобы удалить несвязанный антиген и сохранить тримеры G-белка, связанные с покрытым покрытием антителом (mAb D1).
   6. Переверните микропланшет и дайте ему высохнуть на впитывающей бумаге при комнатной температуре в течение 1 минуты.
5. Связывание пероксидазы, конъюгированной mAb-D1
   1. Распределите 200 мкл на лунку рекомендуемого разведения (1/2000) меченного пероксидазой mAb-D1 в разбавителе (приблизительная концентрация 1 мкг/мл). Рекомендуемая концентрация указана для каждой партии mAb-D1 и должна периодически проверяться положительным контролем.
   2. Накройте микропланшет клейкой пленкой и выдерживайте в течение 1 ч при температуре 37 °C.
   3. Снимите пленку, тщательно отасуньте и перенесите содержимое каждой лунки в реципиент, содержащий 2,5% раствор гипохлорита натрия.
   4. Добавьте в каждую лунку по 300 μл промывочного буфера.
   5. Тщательно отсадите и перенесите содержимое каждой лунки в реципиент, содержащий 2,5% раствор гипохлорита натрия.
   6. Повторите шаги 5.5.4 и 5.5.5 пять раз, чтобы удалить несвязанное антитело, меченное пероксидазой (mAb D1).
   7. Переверните микропланшет и дайте ему высохнуть на впитывающей бумаге при комнатной температуре в течение 1 минуты.
6. Откровение с помощью субстрата-хромогена
   1. Распределите 200 мкл на лунку субстрата-хромогенного раствора.
   2. Запечатайте микропланшет пленкой и выдерживайте в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Развивается желто-оранжевый цвет, интенсивность которого пропорциональна количеству связанных антител, меченных пероксидазой (mAb, D1).
   3. Остановите реакцию, добавив 50 мкл останавливающего раствора на лунку.
   4. Осторожно протрите дно микропланшета и поместите его в спектрофотометр для определения оптической плотности (OD) на длине волны 492 нм всех использованных лунок: отрицательного контроля (пустой), референтной вакцины и тестируемой вакцины.
   5. Собирайте данные OD в формате .xls или .xlsx для анализа.

Таблица 1. Буферы, используемые в анализе.

Буферы и реагенты	подготовка
Буфер для покрытия (Карбонатный буфер 50 мМ pH=9,6)	Добавьте карбонат натрия 50 мМ (Na2CO 3-10H2O) к бикарбонату натрия 50 мМ (NaHCO3) до желаемого pH (около 1/10 объема бикарбоната натрия)
Буфер пассивации	0,3% бычьего сывороточного альбумина (BSA, фракция V), 5% сахарозы в карбонатном буфере 50 мМ pH 9,6
10x Фосфат буферизованный физиологическим раствором pH=7 (PBS 10x)	NaCl 80 г, KCl 2 г, Na2PO 4-12H2O 11,33 г, KH2PO4 2 г в 1 л дистиллированной воды. Отрегулируйте pH=7 с помощью 4N NaOH
Буфер для стирки	0,05% Анимация в 1x PBS
разжижающий	0,5% бычьего сывороточного альбумина (фракция V), 0,05% твин в 1x PBS (отрегулируйте pH до 7 из-за подкисления BSA)
Цитратный буфер pH-5,6 (для пероксидазного субстрата)	11,67 г тринатрия цитрат-2H2O (Na3C6H5O7-2H 20), 2,17 г Лимонная кислота-1H20 в 1л дистиллированной воды
Субстрат-хромогенный раствор	50 мг Орто-фенилендиамин таблетки, 0,1% Перекись водорода 30% (110 об.) в 25 мл Цитратный буфер pH 5,6
Решение для остановки (4N серная кислота)	10 мл H2SO4 36N в 80 мл охлажденной дистиллированной воды. Разведение необходимо проводить на ледяной бане

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шкаф биологической безопасности класса II	ThermoFisher Scientific	10445753	Если титрование живого вируса
Прозрачные иммунонестерильные планшеты с плоским дном 96 лунок, 400 μл, MAXISORP	ThermoFisher Scientific	439454	Хорошо связывается с загруженным антителом
Оборудуйте лабораторный вытяжной шкаф из полипропилена Labo	ThermoFisher Scientific	12576606	Для приготовления серной кислоты
Иммунологическая пластина Strong Адсорбция MAXISORP плоское дно Ну F96	Датчер	55303	Хорошо связывается с загруженным антителом
Лента для микропластин (100 листов)	ThermoFisher Scientific	15036
Однорежимный считыватель Microplate Sunrise	ТЕКАН
Микропланшетный шейкер-инкубатор	Датчер	441504
Микропластинчатая мойка Wellwash	ThermoFisher Scientific	5165000
Многоканальный пипетка (30-300 μл) 12 каналов	ThermoFisher Scientific	4661180Н
Одноканальные пипетки (Набор 2: Finnpipettes F2 0,2-2 мкл микро, 2-20 мкл, 20-200 мкл и 100-1000 мкл)	ThermoFisher Scientific	4700880