$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Связь магнитных наночастиц (MNP)
- Используйте коммерческую процедуру связывания и реагенты для связывания MNP с антителами (Abs) (обычно 1 мг). В качестве реакционноспособных групп используются наночастицы оксида железа с карбоновой кислотой.
- Если антитела находятся в объеме выше 0,5 мл, сконцентрируйте с помощью концентратора 100К. Вращайте при скорости 2 000 x g в течение 3-5 минут.
- В конце процедуры, после добавления 10 μл буфера для гашения, перенесите MNP в пробирку размером 12 мм x 75 мм и добавьте 3 мл буфера для стирки/хранения. Поместите трубку в центральное отверстие магнитного сепаратора и оставьте на ночь при температуре 4 °C.
- Убедитесь, что все MNP собрались сбоку от трубки, а затем осторожно отведите всю жидкость. Добавьте 3 мл свежего буфера для стирки/хранения и поместите обратно в магнит.
- Через несколько часов проверьте, собираются ли МНЧ сбоку от трубки, а затем отведите жидкость от нее с помощью пипетки. Используйте 2 мл буфера для стирки/хранения для ресуспендирования MNP и храните при температуре 4 °C.
- Убедитесь, что Ab связаны с MNP, пометив их соответствующим фрагментом флуоресцентного антитела Fab (например, козий антимышиный препарат при использовании мышиного моноклонального Ab для захвата, как описано в разделе 2) и запустите на проточном цитометре.
2. Мечение антител, связанных с MNP
- Объедините 60 мкл (3,9 x 1012 частиц) MNP (в расчете на кондицию) и 5 мкл (из коммерческого раствора 200 мкг/мл) меченые Fab-фрагменты, специфичные для изотипа захвата Ab, в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.
- Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут при непрерывном перемешивании.
- Предварительно смочите концентратор 100K 300 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и вращайте в микроцентрифуге при давлении 1 500 x g в течение 5 минут.
- Очистите меченые комплексы на колонке 100К. Открутите смесь с шага 2.2 в микроцентрифуге при давлении 1 500 x g в течение 5 минут, промойте 200 μл PBS и восстановите в исходном объеме.
3. Использование меченых комплексов Ab-MNP для захвата интересующих частиц (внеклеточных везикул, EV)
- Инкубируйте предварительно меченые MNP объемом 60 μл (3,9 x 1012 частиц) с препаратом EV (100 μл).
- Готовьте препараты EV с помощью различных методов. Здесь очищают EV на градиентах сахарозы, собирают их из бедной тромбоцитами плазмы с помощью реагентов для осаждения экзосом или изолируют непосредственно из плазмы.
заметка: Оптимальные соотношения должны быть определены для каждого эксперимента и зависят от концентрации EV в препарате. Фракция MNP-Ab должна быть на ~10,6 больше по сравнению с концентрацией фракции EV.
- Инкубировать 1 час при 4 °C для электромобилей.
- Добавьте 2,5% мышиного IgG / человеческого IgG, чтобы блокировать связывание Fc, осторожно завихрите, инкубируйте 3-5 минут при RT.
- Добавьте рекомендованные производителем или титрованные концентрации для каждого обнаруженного Abs и инкубируйте еще 20 минут при RT.
4. Отделение захваченных MNP EV от несвязанных антител с помощью магнитных колонок
- Подготовьте магнитную разделительную колонну к использованию, поместив ее в магнит-сепаратор.
- Предварительно смочите колонку 500 мкл промывочного буфера (2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS). Дайте буферу для промывки протечь через колонну.
- Добавьте в колонну комплексы МНП-ЭВ и дайте протекать всей жидкости. Добавьте в колонку 500 μл промывочного буфера, чтобы пропустить весь объем.
- Повторите стирку с буфером для стирки еще 2 раза.
- Снимите колонку с магнита и поместите в трубку 12 мм х 75 мм для сбора задержанных комплексов МНП-ЭМ. Дайте колонке постоять в трубке от магнита на 3 минуты. Добавьте 200 μл PBS и дайте шарикам стечь вниз под действием силы тяжести, добавьте еще 200 μл PBS и зафиксируйте 200 μл 4% параформальдегида после элюирования.
заметка: Параформальдегид является подозреваемым канцерогеном и должен рассматриваться в вентилируемом капюшоне и следует надевать перчатки.
- Для количественного определения отдельных ВВ используйте волюметрические настройки на высокопроизводительном пробоотборнике (HTS) или непосредственно перед регистрацией добавьте хорошо перемешанные шарики подсчета проточной цитометрии.
5. Анализ МНП-захваченных ВВ с помощью проточного цитометра
- Прогрейте проточный цитометр в течение 30 минут.
- Запустите бусины для контроля качества.
- Установите пороговое значение флуоресценции либо MNP, либо меченых EV. Используйте отфильтрованный PBS 0,22 мкм для порога уменьшения фонового "шума". Установите пороговое значение, регулируя напряжение ФЭУ на уровне, при котором отфильтрованный PBS не выдает событий или выдает их очень мало.
- Запускайте сэмплы на низком уровне. (Используйте дополнительный встроенный фильтр 0,04 мкм для жидкости оболочки, размещенный последовательно за стандартным фильтром оболочки 0,2 мкм, чтобы еще больше исключить ложные события).