$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка биологических образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный анатомический участок и объем сбора крови оставлены на усмотрение каждого отдельного исследователя и не повлияют на результат анализа. Однако, как только они будут получены, образцы следует обрабатывать в соответствии с перечисленными ниже шагами.
- Подготовка образцов сыворотки крови
- Соберите желаемый объем крови в предпочтительную пробирку для сбора и дайте ей свертываться не менее 30 минут.
- Центрифугируйте образец в течение 10 мин при температуре 1000 x g при комнатной температуре.
- Немедленно удалите сыворотку и анализ или аликвоту в полипропиленовые микроцентрифужные пробирки и храните образцы при температуре ≤ -20 °C.
- Подготовка образцов плазмы
- Соберите желаемый объем крови с помощью пробирок для сбора крови, покрытых этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА).
- Центрифугируйте в течение 10 мин при температуре 1000 x g при комнатной температуре в течение 30 мин после сбора.
- Немедленно удалите плазму и анализ или переложите в полипропиленовые микроцентрифужные пробирки и храните образцы при температуре ≤ -20 °C.
- Подготовка образцов надосадочной жидкости культуры тканей
- Центрифугируйте образец в течение 10 минут при 1 500 x g при 4 °C для удаления клеток и мусора.
- Соберите надосадочную жидкость и анализ сразу или аликвоту в полипропиленовые микроцентрифужные пробирки и храните при температуре ≤-20 °C.
- Размораживание замороженных биологических образцов
- Полностью разморозьте все ранее замороженные биологические образцы на льду и в вихре на короткое время перед использованием. Избегайте более 2 циклов замерзания/оттаивания.
заметка: Образцы, используемые в данном протоколе, были получены путем культивирования спленоцитов мышей BALB/c (1 x 106 клеток при 37 °C + 5%CO2 в различных условиях: нестимулированный, ЛПС (100 нг/мл), αCD3 (1 мкг/мл с пластинчатым покрытием) + αCD28 (1 мкг/мл растворимый), PMA (20 нг/мл) + иономицин (500 нг/мл). Супернатанты культуры собирали через 48 ч и обрабатывали в соответствии с описанием в разделе 1.3.
2. Подготовка реагентов
- Приготовление предварительно смешанных антител-иммобилизованных гранул
- Предварительно смешанные шарики обработать ультразвуком во флаконе в течение 1 минуты в ванне с ультразвуковой аппаратурой при комнатной температуре, а затем провести вихрь в течение 30 с перед использованием. Если ванна с ультразвуковой канцелярией недоступна, увеличьте время вихря до 1 минуты.
- Приготовление буфера для промывки
- Доведите 20x Wash Buffer (20x PBS с 1% Tween-20), поставляемый в комплекте, до комнатной температуры и вортекса, чтобы все соли попали в раствор.
- Разбавьте 25 мл 20x Wash Buffer 475 мл деионизированной воды. Храните неиспользованные порции при температуре от 2 °C до 8 °C до одного месяца.
- Подготовка матрицы B (только для использования с образцами сыворотки и плазмы)
- Добавьте 5,0 мл буфера для анализа (PBS с 1% BSA), входящего в комплект, во флакон, содержащий лиофилизированную матрицу B. Подождите не менее 15 минут для полного восстановления, затем хорошо перемешайте вортекс. Остатки восстановленной матрицы B могут храниться при температуре ≤ -70 °C до одного месяца.
3. Подготовка к стандарту
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый аналит в этой панели имеет максимальную стандартную концентрацию 10 000 пг/мл.
- Добавьте 250 мкл буфера для анализа, чтобы восстановить лиофилизированный стандартный коктейль цитокинов мыши Th. Перемешайте путем кратковременного вортекса и дайте флакону постоять при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Переложите стандартный коктейль в полипропиленовую микроцентрифужную пробирку с маркировкой «С7». Это будет использоваться в качестве высшего стандарта.
- Пометьте 6 полипропиленовых микроцентрифужных пробирок как C6, C5, C4, C3, C2 и C1.
- Добавьте по 75 мкл буфера для анализа в каждую из этих пробирок.
- Перелейте 25 μл стандарта C7 в пробирку C6 и хорошо перемешайте путем вортексирования. Это будет стандарт С6.
- Продолжайте выполнять последовательные разведения 1:4 с помощью нового наконечника пипетки для каждой пробирки, чтобы добавить 25 мкл предыдущего стандарта к 75 мкл буфера для анализа в следующей пробирке с самым низким стандартом, а затем выполните вортексинг для получения стандартов C5, C4, C3, C2 и C1. Используйте буфер для анализа в качестве стандарта 0 пг/мл (C0).
4. Разбавление образца
ПРИМЕЧАНИЕ: Могут потребоваться предварительные пилотные эксперименты с использованием этого анализа с многократным разведением для определения наиболее подходящего коэффициента разведения для определенного набора биологических образцов. Надлежащий коэффициент разбавления позволит рассчитать концентрацию для пробы, лежащей в пределах стандартной кривой. Следующие шаги носят рекомендательный характер и, возможно, придется определить эмпирически в зависимости от типа выборки.
- Разбавьте образцы сыворотки или плазмы в 2 раза с помощью буфера для анализа (например, разбавьте 50 л образца 50 л буфера для анализа) в полипропиленовых микроцентрифужных пробирках.
заметка: Если требуется дополнительное разведение образца, для обеспечения точного измерения следует проводить разведение с помощью матрицы B вместо буфера для анализа. Добавление образцов сыворотки или плазмы без разбавления приведет к низкой точности анализа и может засорить фильтрующую пластину. Матрица B состоит из объединенной сыворотки мыши, обедненной эндогенными мишенями для анализа. Он используется в качестве разбавителя образца сыворотки или плазмы, чтобы избежать матричных эффектов, которые, как известно, влияют на аналитическую чувствительность иммунологических анализов.
- Исследуйте образцы надосадочной жидкости клеточной культуры без разведения.
заметка: Уровни аналита могут сильно варьироваться от образца к образцу. При необходимости разбавляют образцы надосадочной жидкости с помощью свежего препарата соответствующей среды для культивирования клеток или буфера для анализа.
5. Процедура анализа
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ может быть выполнен в полипропиленовых фильтровальных пластинах, микрофлуоресцентно-активируемых пробирках для сортировки клеток (FACS) или микропланшетах с V-образным дном. Процедура анализа с помощью фильтровальной пластины рекомендуется из-за хорошей консистенции от образца к образцу, надежности анализа и простоты в обращении. Для этой процедуры требуется установка вакуумной фильтрации для промывки (предоставляется конечным пользователем).
- Перед использованием дайте всем реагентам нагреться до комнатной температуры (20 - 25 °C).
- Устанавливайте фильтрующую пластину на перевернутую крышку пластины во время настройки анализа и инкубации так, чтобы нижняя часть пластины не касалась каких-либо поверхностей, так как это может привести к утечке.
- Держите пластину в вертикальном положении на протяжении всей процедуры анализа, включая этапы промывки, чтобы избежать потери бусин.
- Держите тарелку в темноте или оберните алюминиевой фольгой на всех этапах инкубации.
- Запустите все стандарты и образцы в виде дубликатов, расположенных на пластине в последовательном порядке.
- Предварительно намочите фильтрующую пластину, добавив 100 μL 1x Wash Buffer в каждую лунку, и оставьте на 1 минуту при комнатной температуре (если вы используете микропластину с фильтрующим дном).
- Удалите объем буфера с помощью вакуумного коллектора (5 - 10 с). Вакуум не должен превышать 10 дюймов ртутного столба. Промокните излишки буфера для стирки со дна тарелки, прижав пластину к стопке чистых бумажных полотенец. Поместите пластину поверх перевернутой крышки пластины.
заметка: Шаги 5.1 - 5.2 могут быть пропущены, если анализ проводится с использованием микропланшета с V-образным дном или микропробирок FACS.
- Для образцов надосадочной жидкости клеточных культур добавьте 25 мкл буфера для анализа во все лунки. Добавьте по 25 мкл каждого стандарта в стандартные лунки. Добавьте по 25 мкл каждого образца в лунки для проб.
- Для измерения образцов сыворотки или плазмы добавьте 25 мкл Matrix B в стандартные лунки. Добавьте 25 μл буфера для анализа в лунки для проб. Добавьте по 25 мкл каждого стандарта в стандартные лунки. Добавьте по 25 мкл каждого разбавленного образца сыворотки или плазмы в лунки для образцов.
- Вихревые бусины в течение 30 с. Добавьте по 25 мкл смешанных шариков в каждую лунку, периодически встряхивая бусину во избежание оседания бусин. Итоговый объем должен составлять 75 мкл в каждой лунке после добавления гранул.
- Запечатайте пластину с помощью пломбировщика. Оберните всю тарелку, включая перевернутую крышку пластины, алюминиевой фольгой. Поместите тарелку на шейкер для тарелок, закрепите ее и встряхивайте со скоростью примерно 500 об/мин в течение 2 часов при комнатной температуре. Во избежание утечки не нажимайте на герметик пластин
.
- Не переворачивая, поместите пластину на вакуумный коллектор, примените вакуум, как и раньше, и добавьте 200 мкл 1x промывочного буфера в каждую лунку.
- Удалите содержимое лунок с пробирной пластины методом вакуумной фильтрации. Промокните излишки буфера для стирки с нижней части тарелки впитывающей салфеткой или бумажными полотенцами. Повторите этот шаг еще раз.
заметка: Если анализ проводится с использованием микропланшета с V-образным дном или микропробирок FACS, пропустите шаги 1.12 и 1.13. Вместо этого центрифугируйте планшет при давлении 1000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, затем удалите надосадочную жидкость с помощью многоканальной пипетки.
- Добавьте в каждую лунку по 25 мкл антител для обнаружения (см. Таблицу материалов).
- Запечатайте пластину свежим герметиком. Оберните всю тарелку, включая перевернутую крышку пластины, алюминиевой фольгой.
- Поместите тарелку на шейкер для тарелок и встряхивайте со скоростью примерно 500 об/мин в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Не вакуумируя, добавьте 25 мкл стрептавидин-фикоэритринового реагента (SA-PE) непосредственно в каждую лунку. Разбавление реагента не требуется.
- Запечатайте пластину свежим герметиком. Оберните всю тарелку, включая перевернутую крышку пластины, алюминиевой фольгой.
- Поместите тарелку на шейкер для тарелок и встряхивайте со скоростью примерно 500 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Повторите шаг 1.13 выше.
- Добавьте 200 μL 1x Wash Buffer в каждую лунку. Снова подвесьте бусины на шейкере для тарелок на 1 минуту.
- С помощью многоканального пипета перенесите образцы с фильтрующей пластины в пробирки FACS для считывания образцов на проточном цитометре.
заметка: Объем образца может быть увеличен с 200 мкл до 300 мкл, если добавить дополнительные 100 мкл 1x промывочного буфера в каждую пробирку, чтобы избежать высыхания образца. При необходимости образцы могут храниться при температуре 4 °C, защищенные от света, и анализироваться на следующий день. Однако длительное хранение образца может привести к снижению сигнала.