$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Выделение дендритных клеток, ассоциированных с опухолью, полученных из моноцитов
- В колпаке с ламинарным потоком удалите опухоли у усыпленныхCO2 мышей и поместите опухоли в среду RPMI без фетальной бычьей сыворотки (FBS).
заметка: Настоятельно рекомендуется побрить мышей и распылить на них 70% этанол перед удалением опухолей, чтобы свести к минимуму потенциальные загрязнения от шерсти. Следите за тем, чтобы размер опухоли не превышал 25 - 40мм2, так как более крупные опухоли имеют меньше дендритных клеток (ДК), которые, как правило, хрупкие и склонны к гибели клеток. Если требуется большее количество ДК, каждой мыши можно ввести опухолевые клетки в несколько мест.
- Под стерильным ламинарным капюшоном измельчите опухоли на мелкие кусочки (примерно 1 х 1 мм2 ) с помощью хирургических ножниц.
- Добавьте все фрагменты опухоли от одной мыши в 30 мл стерильную пробирку с плоским дном с магнитными мешалками, содержащую 5 мл сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS), 2 мг/мл коллагеназы IV и 0,01 мг/мл ДНКазы I.
осторожность: Миелоидные клетки вырабатывают энергию за счет гликозилирования, даже в равновесном состоянии. Следовательно, используйте только среды, содержащие глюкозу (например, HBSS, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) и модифицированную орлиную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)), так как глюкозное голодание в течение всего 10-15 минут приведет к гибели клеток и апоптозу в течение 24 часов. Используйте только низкое содержание эндотоксинколлагеназы внутривенно, так как коллагеназа продуцируется грамположительными бактериями (Clostridium histolyticum).
- Перемешивайте со скоростью около 200 - 400 об/мин в инкубаторе с температурой 37 °C с магнитной мешалкой в течение 20-30 минут.
- Добавьте 5 мл готового носителя и энергично снова суспензируйте.
- Фильтруйте ячейки через сетчатый фильтр 70 мкм. Центрифуга при 4 °C 400 rcf в течение 5 - 10 мин для гранулирования ячеек.
осторожность: Не пытайтесь изолировать клетки сразу после ферментативного расщепления, так как некоторые опухоли являются некротическими и содержат относительно большое количество клеточного мусора или внеклеточного матрикса. Нанесите ячейки на среду с градиентом плотности 15%, чтобы получить только ячейки.
- Суспендируйте 9 мл градиентной среды с 1 мл 10-кратного фосфатно-солевого буфера (PBS) для регулировки осмоляльности и получения 100% стокового раствора Percoll. Смешайте 1,5 мл градиентного раствора средней массы с 8,5 мл HBSS и энергично перемешайте его с опухолевой клеточной гранулой. Аккуратно нанесите 2 мл DMEM поверх среды с градиентом плотности 15% и центрифугируйте при температуре 400 rcf в течение 20 минут при комнатной температуре. Откажитесь от надосадочной жидкости, так как клетки будут образовывать гранулу на дне трубки.
- Дважды промойте гранулированные клетки, повторно суспендируя их в 10 мл HBSS, содержащем 2% FBS, 1% пенициллин/стрептомицин и 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (изоляционный буфер), и центрифугируйте при 4 °C 400 rcf в течение 5-10 минут для гранулирования клеток.
- Подсчитайте клетки на гемоцитометре с помощью трипанового синего под световым микроскопом.
- Повторно суспендировать 1 x 108 клеток в изоляционном буфере объемом 1 мл и инкубировать их при температуре 4 °C с 30 мкл CD11b+ конъюгированных магнитных шариков в течение 15 мин.
ВНИМАНИЕ: Избегайте использования CD11c-конъюгированных гранул, так как это активирует ДК и вызовет гибель клеток. Не пытайтесь блокировать FcγRII и FcγRIII антителами против CD16/32. Блокирующие антитела лигатируют FcγR, индуцируют сильное фосфорилирование митоген-активируемых протеинкиназ (MAP) и праймируют DC.
- Удалите излишки несвязанных шариков, добавив 9 мл изоляционного буфера, и центрифужные ячейки при 400 мкс в течение 5 - 10 мин при 4°С.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в изоляционном буфере объемом 1 мл. Нанесите ячейки на предварительно промытую магнитную колонку. Дважды промойте колонку 3 мл изоляционного буфера.
- Снимите колонку с магнита. Нанесите пипеткой 6 мл изоляционного буфера на колонку и промойте помеченные магнитом клетки в стерильную пробирку для сбора, нажав на поршень. Центрифужные ячейки при 400 мкс в течение 5 - 10 мин при 4 °С.
- Ресуспендировать клетки в дозе 100 мкл на 1 x 107 клеток и окрашивать следующими фторофор-конъюгированными антителами: Linage negative (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI и Ly6G), MHCII, Ly-6C.
- Отсортируйте клетки путем гейтирования мелких клеток с помощью бокового рассеяния (SSC) и прямого рассеяния (FSC) и культивируйте в полной среде с добавлением GM-CSF с концентрацией 5 нг/мл — инкубируйте клетки в течение 1 часа при 37 °C, чтобы макрофаги могли прилипнуть к планшету. Затем перенесите свободные и неадгезивные клетки в чашку для новой культуры.
заметка: MoDC мыши определяются как CD11b+/CD11c+/MHCIIhi/Ly6Clo/int. Экспрессия Ly6C может сильно различаться между опухолевыми моделями, и в некоторых моделях (например, LMP) MoDCs полностью лишены экспрессии Ly6C. Одна опухоль B16F10 размером 100мм3 обычно содержит 5 x 104 DC, в результате чего получается примерно 4 - 5 x 106 клеток. Из этих клеток 10 - 15% являются иммунными клетками и 8 - 10% - MoDC. Увеличение числа DC может быть достигнуто путем введения мышам опухолей в несколько мест. Сортируйте только небольшие клетки SSC/FCS, так как другие миелоидные клетки могут экспрессировать такие маркеры, как CD11c и Ly6C.
необязательный: Отсортируйте инфильтрирующие опухоль моноциты как небольшие клетки SSC/FSC, экспрессирующие Ly6Chi и отрицательные на MHCII. После этого культивируют моноциты in vitro с 50 нг/мл GM-CSF для получения ДК.
2. Получение иммунокомплексов Tumor-IgG
- Культивирование опухолевых клеток в колбе 75 см2 до 70% конфлюенции в полной среде DMEM.
- Добавьте 2 мл 0,25% трипсина/ЭДТА, чтобы отделить клетки от колбы для культивирования и контролировать морфологию клеток под световым микроскопом, чтобы избежать чрезмерной трипсинизации.
- Добавьте 8 мл полной питательной среды (на 2 мл трипсина) для ингибирования расщепления трипсина и центрифугируйте при 4 °C, 400 rcf в течение 5-10 минут для гранулирования клеток.
заметка: Проверьте опухолевые клетки на микоплазму с помощью коммерческого набора для ПЦР. Тест на грамотрицательные бактерии и грибковые эндотоксины с использованием анализа лизата амебоцитов Limulus (LAL). Сыворотка должна быть отфильтрована через 0,22 мкМ и проверена на вирусы 9 Свода федеральных правил. Кроме того, протестируйте питательные среды и сыворотки, капнув 100 - 200 мкл на LB агар или бульон, и закваливайте в течение 2 дней при 37 °C.
- Снова промойте клетки от трипсина и остатков сыворотки путем повторного суспендирования их в 10 мл PBS и центрифугируйте при 400 мкс в течение 5 - 10 мин. Асируйте надосадочную жидкость и повторите промывание еще 2 раза.
- Зафиксируйте клетки в 1,8% буферизованном параформальдегиде на 10 мин при комнатной температуре.
- Промойте клетки, повторно суспензив их в 10 мл PBS и центрифугируйте при 4 °C 400 rcf в течение 5 - 10 минут.
- Аспиратируйте надосадочную жидкость и повторите промывание еще два раза.<бр/>
необязательный: Для анализа поглощения опухоли клетки могут быть помечены путем их инкубации в течение 5 мин при 37 °C в PBS, содержащем 1 мкМ карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир (CFSE). Затем CFSE закаливают на готовом материале в течение 10 минут во льду. Клетки следует тщательно промыть в PBS, содержащем 2% сыворотки, для удаления остатков красителя.
- Ресуспендируйте клетки в буфере для сортировки клеток, активируемом флуоресценцией (FACS) (PBS с добавлением 2% FCS + 5 мМ ЭДТА) и 0,5 мкг/мл анти-CD16/32 для блокирования потенциальных неспецифических белок-белковых взаимодействий. Планшет в форме буквы U 96 лунок/планшет в концентрации 1 х 105 ячеек на 100 мкл.
- Добавляйте различные разведения опухолесвязывающих антител в диапазоне от 5 мкг до 5 нг/1 х 105 клеток. Инкубировать тарелку на льду в течение 15-20 мин.<бр/>
заметка: Антитела IgG были выделены из сыворотки крови наивных самок мышей в возрасте 20-24 недель на столбцах белка А, как описано.
- Промойте ячейки, добавив 150 μL PBS и центрифугируя планшет при 4 °C 400 rcf в течение 5 - 10 минут.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторите стирку дважды. Повторно суспендируйте клетки в 100 мкл буфера FACS, содержащего вторичное антитело, конъюгированное с флуорофором. Выдержать тарелку на льду в течение 20 минут.
- Промойте ячейки, добавив 200 μL буфера FACS и центрифугируя планшет при 400 rcf в течение 5 - 10 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторите промывку.
- Анализ связывания опухоли с помощью проточной цитометрии и определение минимальной концентрации, необходимой для покрытия клеток.
заметка: Антитела, которые не увеличивают среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) окрашенных опухолевых клеток не менее чем в пять раз по сравнению с контролем изотипа, не следует использовать в последующих функциональных анализах.
3. Активация MoDC с помощью Tumor-IgG IC
- Покрытие опухолевых клеток минимальной концентрацией IgG, как описано в разделах 2.1 - 2.4.3
- За сутки до активации MoDC опухолевыми ИЦ замените питательные среды MoDC, содержащие GM-CSF. Для этого осторожно отсасывайте среду и промойте клетки предварительно подогретой питательной средой.
заметка: Выделенные зрелые опухолеассоциированные MoDC следует культивировать в течение не менее 2 - 3 ч (или даже в течение ночи) после сортировки в полноценных средах без GM-CSF и перед их активацией с помощью IC.
- Для анализа поглощения опухоли добавьте меченую CFSE опухоль IC к MoDC в соотношении 1:5 (IC: MoDC) и инкубируйте в течение ночи в течение 12–16 часов в 1 мл готовой среды на 1 x 106 DC.
- Для анализа FACS экспериментов по активации MoDC добавьте tumor-IC в соотношении 1:1 (IC: MoDC) и инкубируйте в течение ночи в течение 12 - 16 ч.<бр/>
заметка: Настоятельно рекомендуется включить положительную контрольную лунку, в которой MoDC стимулируют 1 мкг/мл ЛПС или других агонистов TLR.
- После ночной активации аспирируйте надосадочную жидкость и осторожно промойте клетки три раза с помощью изоляционного буфера или 10 mM EDTA HBSS.
- Чтобы отделить ДК от планшета, инкубируйте клетки в течение 2 - 3 минут в 1 мл HBSS, содержащем 10 мМ ЭДТА, и отделите клетки с помощью энергичного пипетирования.
- Центрифугируют клетки при 400 RCF и повторно суспендируют 1 x 106 DC в 90 мкл PBS с добавлением 2% FCS, 5 mM EDTA (FACS буфер) и 0,5 μг блокирующих антител. Выдерживать на льду в течение 5 - 10 минут.
- Добавьте в клетки 10 μл смеси окрашивающих антител и инкубируйте на льду в течение 15 минут.
- Добавьте в ячейки 2 мл буфера FACS и центрифугируйте при 4 °C 400 rcf в течение 5 - 10 минут.
- Повторно суспендируйте элементы в буфере FACS объемом 200 μл.
- Добавьте 0,5 - 1 г/мл DAPI за 1 - 2 минуты до запуска проб, чтобы исключить мертвые клетки из анализа. Не переусердствуйте с инкубацией DAPI, так как MoDC впитает ее в течение 10–15 минут.