$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Срез ткани и подготовка предметного стекла
- Разрежьте срезы фиксированных формалином и залитых парафином тканей толщиной 3-5 мкм с помощью микротома.
- Всплыть секции на очищенную воду с температурой примерно на 10 °C ниже температуры плавления используемого парафина. Поднимите срезы из воды на специально обработанные предметные стекла микроскопа (см. Таблицу материалов). Дайте воде тщательно стечь с горок.
- Инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 50 °C для улучшения адгезии тканей к предметному стеклу.
заметка: Предпочтительно подготавливать свежесрезы тканей для протоколов ИГХ, хотя срезы положительного и отрицательного контроля ТГЭ могут быть подготовлены заранее и сохранены. Шаги со 2 по 4 должны быть выполнены в вытяжном шкафу для химикатов.
2. Депарафинизация и регидратация
- Поместите слайды с срезами ткани в корзину для окрашивания из нержавеющей стали (см. Таблицу материалов). Погрузите корзину в ванну с ксилолом (емкость для окрашивания из нержавеющей стали) на 3 минуты, выньте и погрузите еще раз.
- Удалите ксилол и увлажните секции, погрузив их в ванну с абсолютным этанолом на 3 мин. Снимите и погрузите еще раз.
- Высушите секции на воздухе и поместите в ванну с 90% этанолом на 1 мин. Переложите в ванну с 70% этанолом еще на минуту, а затем окончательно переложите в ванну с 50% этанолом на 1 минуту. Для каждой процедуры в ванне с этанолом дважды осторожно перемешивайте корзину с горками и осушите корзину перед следующей перекладкой.
3. Извлечение эпитопов
- Осторожно погрузите срезы тканей в 98% муравьиную кислоту комнатной температуры на 30 мин. Промойте срезы в водопроводной воде в течение 5 мин, после чего дважды промойте в дистиллированной воде><.
осторожность: Муравьиная кислота обладает высокой коррозионной активностью. Необходимо надеть защитные очки и перчатки.
- Проведите извлечение антигена, вызванного нагревом (HIER), выполнив следующие действия.
заметка: Этот этап выполняется путем гидратированного автоклавирования при 121 °C в течение 30 минут в специальной камере давления (см. Таблицу материалов).
- Предварительно нагрейте цитратный буфер (10 мМ, pH 6,1, см. таблицу материалов) до 98 °C в течение примерно 20 минут в контейнере для окрашивания из нержавеющей стали, помещенном внутри барокамеры, заполненной 500 мл дистиллированной воды><.
заметка: В настоящем исследовании программа Set Point была равна 1 (SP1) для конкретного используемого оборудования.
- После того как сигнал тревоги укажет, что оборудование достигло запрограммированного времени и температуры, погрузите корзину с горками и запустите программу до заданного значения 2 (121° C в течение 30 мин). В целях контроля качества поместите на корзину секцию клейкой автоклавной индикаторной ленты, чтобы контролировать температуру и давление, а также записывать начальное и конечное давление этой программы.
- Если количество предметных стекол, подлежащих иммуноокрашиванию, не достигает емкости корзины, используйте чистые пустые предметные стекла, чтобы занять пустые позиции. После завершения программы дайте возможность пассивному возвращению камеры к давлению окружающей среды (не менее 30 мин).
заметка: Более длительная продолжительность может уменьшить неспецифическое фоновое окрашивание.
- Осторожно переложите корзину с горками в емкость для окрашивания из нержавеющей стали, наполненную дистиллированной водой, на 5 минут.
4. Инактивация эндогенной пероксидазы
- Погрузите корзину с образцами в ванну с 3% перекисью водорода (Н2,О2) в метанол на 30 мин. Промойте срезы под проточной водой (5 мин). Слейте воду и погрузите секции в 1x Трис-буферный физиологический раствор (TBS) еще на 5 минут.
5. Иммунодетектирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования иммунодетектирование проводилось с использованием формата капиллярного промежутка с использованием коммерчески доступной системы сборки зажимов для слайдов (см. Таблицу материалов). Также применимы другие иммуногистохимические системы предметных стекол.
- Поместите каждую задвижку на имеющийся в продаже держатель накладки (см. Таблицу материалов), предварительно смоченный TBS, избегая образования пузырей, стороной от салфеток и краями направляющих совпадают с двумя нижними точками держателя.
- Удерживайте держатель предметного стекла между большим и указательным пальцами, при этом один палец находится на верхней части предметного стекла, а другой — на нижней части держателя. Затем поместите сборку в галерею системы.
- Чтобы убедиться, что набор хорошо собран, заполните лунку между предметным стеклом и держателем TBS, которая не должна сразу переполниться. С этого момента убедитесь, что между держателем и предметным стеклом должно оставаться около 80 мкл TBS. Не допускайте высыхания секций.
- После попадания в систему, для снижения фонового окрашивания перед обработкой первичным антителом (антителом против прионных белков (анти-PrP), см. Таблицу материалов), предварительно инкубируйте предметные стекла с 20% нормальной сывороткой того же вида, что и вторичное антитело-хозяин, используемое для иммуноокрашивания (в данном случае лошадиной сывороткой) в течение 30 минут в условиях TBS.
- Размораживание количества аликвот антител, которые должны быть использованы, в соответствии с видом анализируемого животного, количеством исследуемых образцов и количеством рабочего разведения.
заметка: Для достижения наилучших результатов используйте 10% нормальной сыворотки того же вида в качестве источника вторичных антител и растворов первичных антител. Если возможно, для достижения наилучших результатов хозяин-источник нормальной сыворотки и вторичного антитела должен принадлежать к одному и тому же виду.
- Не промывая срезы, нанесите раствор первичного антитела непосредственно (200 мкл) в каждую лунку набора слайдодержателей и инкубируйте в течение 60 мин при комнатной температуре.
- Для промывки заполните лунки наборов слайдодержателей TBS и подождите 5 мин. Повторите дважды.
- Разведите биотинилированное вторичное антитело (моноклональное антимышиное антитело Horse Ab, см. Таблицу материалов) в дозе 1/200 в TBS с 10% лошадиной сывороткой. Подготавливайте необходимый объем в зависимости от количества обрабатываемых срезов.
- Нанесите вторичный раствор антитела (200 μл) на каждую лунку набора патронов для стекла. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре.
- Постирайте, как описано в пункте 5.5.
- Для инкубации с пероксидазой авидин-биотинового комплекса (комплекс ABC/HRP, см. таблицу материалов) реагент готовят за 30 мин до применения. Нанесите комплексный раствор ABC/HRP (200 μл) в каждую лунку набора держателей слайдовых пластин. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре.
- Постирайте, как описано в пункте 5.5.
6. Разработка с помощью хромогена 3,3' диаминобензидина (DAB)
ВНИМАНИЕ: DAB - это потенциальный канцероген. В результате при работе с этим реагентом необходимо соблюдать надлежащий уход, включая защиту глаз, лабораторные халаты, перчатки и хорошие лабораторные процедуры. Утилизируйте в соответствии с местными правилами.
- Разведите хромоген в соответствии с инструкцией производителя (см. Таблицу материалов) непосредственно перед применением. Нанесите раствор хромогена (400 мкл) на каждую лунку набора предметных пластин
.
- Выдерживать до 30 минут при комнатной температуре. В положительных срезах PrPSc (аномальная изоформа прионных белков) обычно достаточно 10-минутного инкубационного периода.
- Удалите остатки раствора хромогена, промыв предметные стекла в дистиллированной воде. Снимите предметные стекла с держателей крышек и поместите их в пластиковый контейнер с дистиллированной водой.