Обнаружение аномальных прионных белков в тканях мозга с помощью иммуногистохимии

Аннотация

Источник: Orge, L., et al. Обнаружение аномального прионного белка с помощью иммуногистохимии. J. Vis. Exp. (2023).

Это видео демонстрирует метод обнаружения неправильно свернутого прионного белка в срезах мозга с помощью иммуногистохимии. После обработки участка мозга муравьиной кислотой для денатурации прионов и минимизации риска инфекции, а также демаскирования прионных агрегатов с помощью индуцированного теплом извлечения эпитопов, срезы иммуномаркируются для неправильно свернутых агрегатов прионных белков и наблюдаются под микроскопом.

Протокол

1. Срез ткани и подготовка предметного стекла

1. Разрежьте срезы фиксированных формалином и залитых парафином тканей толщиной 3-5 мкм с помощью микротома.
2. Всплыть секции на очищенную воду с температурой примерно на 10 °C ниже температуры плавления используемого парафина. Поднимите срезы из воды на специально обработанные предметные стекла микроскопа (см. Таблицу материалов). Дайте воде тщательно стечь с горок.
3. Инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 50 °C для улучшения адгезии тканей к предметному стеклу.
   заметка: Предпочтительно подготавливать свежесрезы тканей....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Абсолютный этанол	Лабхим	ЛБ0507-9010	неразбавленный
			Разведенные на 90%, 70% и 50% в дистиллированной воде
Авидин-биотиновый комплекс и пероксидаза Пероксидаза Vectastain Elite ABC kit	Лаборатория «Вектор	ПК-6100	Приготовьте и аккуратно перемешайте за 30 минут до использования в соответствии с инструкциями набора. Не перемешивайте после стояния.
Биотинилированное вторичное антитело (Horse anti-mouse IgG H+L)	Лаборатория «Вектор	БА-2000-1,5	Разведите в дозе 1/200 в TBS с 10% лошадиной нормальной сывороткой. Подготавливайте необходимый объем в зависимости от количества секций.
Хромоген диаминобензидин-DAB, набор субстратов, пероксидаза	Лаборатория «Вектор	СК-4100	Подготовьте перед использованием в соответствии с инструкциями по набору. Используйте 400 μл раствора на секцию.
Барокамера DakoCytomation Pascal	ДАКО	С2800
Гематоксилин Эрлиха:
Абсолютный этанол	Лабхим	ЛБ0507-9010
Ледяная уксусная кислота	Мерк	101830 Номер 101830
Квасцы калия	Мерк	1.01047.1000
глицерин	Мерк	1.04091.1000
Раствор эндогенной пероксидазы Блок (3% концентрацияН2О2):			40 мл перекиси водорода (30% по массе) в 360 мл метанола. Подготовьте перед использованием
Перекись водорода (30% по массе)	Шарлау	ХИ0136
метанол	Сигма Олдрич	322415-2Л
Муравьиная кислота 98%	Мерк	1.00264.1000	неразбавленный
микротом	Шаньдон-AS325	микротом	Шаньдон-AS325
Нормальный сывороточный (20% ) блочный раствор в TBS: Нормальная сыворотка для лошадей	Gibco	16050-122	Подготовьте окончательный объем в соответствии с количеством срезов в анализе (200 мкл раствора на секцию).
Первичное антитело против PrP мыши MAb 2G11	БИОРАД	MCA2460	ПрП 146-R154R171182<бр/> Овцы, в том числе нетипичные скрейпи, цервины, кошачьи. Не подходит для крупного рогатого скота. В зависимости от количества срезов в анализе (200 мкл раствора на срез) и разведения антител получают конечный объем в TBS с добавлением 10% нормальной сыворотки из видов, в которых было поднято вторичное антитело (нормальная сыворотка лошади) Обычное разведение антител: MAb 2G11 1/100, но рабочее разведение должно быть установлено в каждой новой партии, чтобы получить концентрацию, дающую самую сильную мечение с наименьшим фоном. Для хранения заморозьте аликвоты объемом не менее 10 мкл в стерильных микропробирках. Разморозьте и используйте по одной аликвоте за раз.
Первичное антитело против PrP мыши MAb 12F10	Каймановы химические компании	189710	ПрП142-160<бр /> Говядина, не подходит для овцы<бр /> Обычное разведение антител: 1/200, но также должно быть установлено рабочее разведение. Подготовка как MAb 2G11
Камера Shandon CoverplateTM	Термо Сайентиал	72110017
Шандон Секвенза® Иммунстейнинг центр	Термо Сайентиал	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining решетка для слайдов	Термо Сайентиал	73310017
Раствор цитратного буфера (10 мМ pH 6,1):			2,55 г дигидрата цитрата натрия и 0,255 г лимонной кислоты в одном литре очищенной воды. Отрегулируйте рН рабочего раствора до 6,1 с помощью 10 мМ раствора лимонной кислоты (1,05 г лимонной кислоты в 500 мл очищенной воды)<бр/> Приготовьте в день пробы.
Дигидрат цитрата натрия дигидрат	Сигма-Олдрич	С4641-500Г
лимонная кислота	Сигма Олдрич	С0759
Окрашивание баночки и корзины	Дельталаб	19360
		19361
Предметные стекла для микроскопа Superfrost Plus	ВВР	631-0108
Трис-буферизованный физиологический раствор (TBS) (50 мМ основание ТРИЗМА; 0,8% NaCI; pH 7,6):			10xTBS (стоковый раствор 0,5 м основания ТРИЗМЫ; 8% NaCI; pH 7,6): БАЗА ТРИЗМА 60,57 г и NaCl 80 г в 800 мл очищенной воды. Отрегулируйте pH исходного раствора с помощью соляной кислоты 37% и конечный объем до одного литра с очищенной водой (держите 5± 3 °C до 2 месяцев)<бр/> Разведите стоковый раствор TBS на 1/10 в день анализа.
БАЗА ТРИЗМА	Сигма Олдрич	Т6066-1КГ
Хлорид натрия (NaCl)	Мерк	106404
ксилол	Реагенты Panreac Applied Chem ITW	251769	неразбавленный

» » » г. г.