Методика обнаружения штаммов цианобактерий с помощью микрочипа антител

Аннотация

Источник: Blanco, Y. et al., Экспериментальный протокол для обнаружения цианобактерий в жидких и твердых образцах с помощью чипа микрочипа антител.J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует метод обнаружения штаммов цианобактерий в образце окружающей среды с помощью микрочипа антител. Образцы, несущие различные бактерии, взаимодействуют с напечатанными антителами, а иммуноокрашивание мечеными флуорофорами антителами к цианобактериальным штаммам выявляет присутствие специфических штаммов цианобактерий за счет флуоресценции в отдельных пятнах.

Протокол

1. Получение иммуногенов

1. Выращивайте каждый штамм цианобактерий в соответствующей питательной среде в условиях, описанных в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда и условия культивирования для каждого штамма цианобактерий приведены в таблице 1. Все штаммы цианобактерий, за исключением K17, принадлежат к группе Антонио Кесады из Университета Автономии (Мадрид, Испания). Антитело против Planktothrix rubescens было получено из естественного образца моновидового цветения этой цианобактерии из водохранилища Виласуто (северная Испания).
2. Количественно оцените количество клеток с помощью камеры для подсчета клеток с помощью оптической микроскопии, чтобы получить приблизительно^10-8 клеток/мл из культуры поздней экспоненциальной или стационарной фазы роста.
3. Соберите клетки из 5 мл культуры путем центрифугирования при 2000 x g в течение 5 мин.
4. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в пробирке объемом 10 мл с 5 мл 1x фосфатно-солевого буфера (1x PBS) до получения около 10-8 клеток/мл.
5. Гомогенизировать и лизировать клетки суспензии ультразвуком в течение 5 циклов по 30 с каждым, с паузой на льду от 30 до 60 с, с помощью портативного ручного ультразвукового процессора или путем погружения трубки в водяную баню клеточного разрушителя с максимальной амплитудой (30 кГц).
6. Повторите шаги 1.3 - 1.5 для каждого штамма цианобактерии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ультразвуковая обработка приводит к разрушению клеток и высвобождению клеточного содержимого. В то время как белки и полисахариды являются хорошими иммуногенами, специфические молекулы, такие как липиды и нуклеиновые кислоты, сами по себе не вызывают гуморального иммуногенного ответа. Следовательно, они должны связываться с носителями, такими как полисахариды или белки, чтобы увеличить молекулярную сложность. Кроме того, ультразвуковая обработка высвобождает внутриклеточный материал, который может вызвать выработку антител.

2. Производство поликлональных антител

1. Приготовьте первую дозу иммуногена, смешав 0,5 мл ультразвукового лизата клеток, полученного на шаге 1,5, с 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда. Доставить его оператору животноводческого комплекса для производства поликлональных антител к кроликам.
2. Приготовьте еще три дозы, как и раньше, для дальнейшего использования в качестве стимуляторов памяти в процессе производства антител путем смешивания 0,5 мл того же гомогената/лизата, полученного на стадии 1,5, с 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда. Дайте их животному для выполнения процесса производства антител.
3. Повторяйте шаги 2.1 и 2.2 для каждого нового процесса производства антител.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, производство антител доверяется специализированным животноводческим предприятиям или компаниям, поскольку для работы с животными требуется соответствующее лицензирование и обучение. Компании поставляют метод иммуноферментного анализа (ИФА) для измерения количества антиген-специфических антител, присутствующих в образце сыворотки крови.

3. Очистка антител

1. Очистите фракцию иммуноглобулина G (IgG) как из иммунной, так и из преиммунной сыворотки, собранной на этапе 2, с помощью аффинной хроматографии белка-А. Хорошо работают некоторые коммерческие наборы для очистки, основанные на картриджных системах; Следуйте инструкциям провайдера.
2. Если набор для очистки не обеспечивает систему обессоливания, замените буфер после элюирования очищенных антител до 0,1x PBS либо путем диализа, либо с помощью центробежных фильтрующих устройств с размером пор мембраны 100 кДа (или ниже).
3. Определение концентрации антител путем измерения абсорбционной способности при длине волны 280 нм или с помощью колориметрических методов, таких как метод Брэдфорда, Лоури или бицинхониновая кислота (BCA).
   Важно избегать включения аминных групп в элюирующий буфер (например, трис-буферы), поскольку они конкурируют с антителом за связывание с твердыми поверхностями, активированными эпоксидными группами. После очистки важно проверить активность антител с помощью ИФА.

4. Мечение флуоресцентными антителами

1. Маркируют очищенные антитела, полученные в разделе 3, флуорохромом (например, дальним красным флуоресцентным красителем) путем растворения коммерческого флакона, содержащего краситель для мечения 1 мг белка в 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). Добавьте 2 мкл растворенного красителя в каждый препарат антитела в концентрации 2 мг/мл в конечном объеме 50 мкл в 50 мМ фосфатно-солевом буфере (pH 8,5).
2. Реакции мечения выдерживают при непрерывном перемешивании в течение 1 ч при температуре окружающей среды и 1 200 об/мин на вибрационной платформе.
3. Очистите меченые антитела с помощью эксклюзионной хроматографии (например, с использованием геля с диапазоном фракционирования от 1,5 до 30 кДа, захваченного в колонку), следуя рекомендациям поставщика.
4. Измерьте поглощение при длинах волн 280 нм и 650 нм в элюатах и рассчитайте эффективность маркировки в соответствии с рекомендациями поставщиков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: До 50 реакций мечения антител объемом 50 мкл можно провести с помощью одного флакона флуоресцентного красителя для мечения 1 мг белка. Рекомендуется накрыть пробирки алюминиевой фольгой или, в качестве альтернативы, использовать непрозрачные пробирки объемом 0,5 мл, чтобы избежать процессов гашения после шага 4.3. Для антител IgG оптимальная мечение достигается с помощью 3-7 моль красителя на моль антитела.

5. Производство CYANOCHIP

1. Антитела и средства контроля в печатном растворе
   1. Приготовьте 30 мкл каждого очищенного антитела в печатном растворе, смешав каждое антитело в концентрации 1 мг/мл в коммерческом 1x белковом печатном буфере с 0,01% (v/v) Tween 20 (неионогенное моющее средство), все в качестве конечных концентраций.
      Примечание: В качестве альтернативы, раствор антитела может содержать 20% глицерина, 1% (по массе) сахарозы (или трегалозу, в качестве консерванта) и 0,01% (по массе) Tween 20 в карбонатном буфере (pH 8,5).
   2. Приготовьте 30 мкл печатного раствора в качестве контроля: (a) 1x белковый печатный буфер с 0,01% (v/v) Tween 20, (b) очищенную преиммунную сыворотку protein-A в концентрации 1 мг/мл в 1x белковом печатном буфере с 0,01% (v/v) Tween 20 и (c) бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрации 1 мг/мл в 1x белковый печатный буфер с 0,01% (v/v) Tween 20.
   3. Приготовьте 30 мкл флуоресцентно меченной, очищенной преиммунной сыворотки в различных концентрациях (например, от 50 мкг/мл до 1 мкг/мл) в 1x белковом печатном буфере с помощью Tween 20, как на шаге 5.1.1. Эти образцы будут использоваться в качестве флуоресцентных кадровых маркеров и для количественного определения относительной флуоресценции после пятнистости.
   4. Добавьте 30 μL на лунку печатных растворов, приготовленных на этапах 5.1.1, 5.1.2 и 5.1.3, в высококачественные 384-луночные микропланшеты для производства микрочипов, такие как полипропилен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белковый печатный буфер повышает качество и стабильность антител, а Tween 20 гомогенизирует морфологию пятна и наращивает белковую связь. Перед использованием рекомендуется поддерживать 384-луночный микропланшет при температуре 4 °C. Храните его при температуре -20 °C в течение длительного периода времени. Полипропилен имеет низкое содержание ДНК, белка, клеточного экстракта и собственных связей с малыми молекулами.
2. Печать антител на предметном стекле микроскопа
   ПРИМЕЧАНИЕ: Распечатайте антитела на активированных предметных стеклах микроскопа, используя различные матричные платформы, такие как контактные, с разделенными иглами или бесконтактные устройства, такие как пьезоэлектрические принтеры или «струйные» технологии. В этой работе CYANOCHIP обычно печатался контактным способом с использованием роботизированной системы (arrayer), способной обнаруживать nL количества антител в масштабе μm.
   1. Установите условия окружающей среды в типографии на уровне 20 °C и относительную влажность воздуха 40 - 50%.
   2. Настройте подложки предметного стекла (например, стеклянные стекла эпоксидно-активированного микроскопа размером 75 x 25 мм) для выполнения нескольких идентичных массивов антител на каждом предметном стекле.
   3. Выявляйте каждое очищенное антитело, включая контроль и систему отсчета, в тройной форме пятен; в этих условиях пятна имеют диаметр 180 - 200 мкм.
   4. После печати оставьте слайды не менее чем на 30 минут при температуре окружающей среды, чтобы они высохли, а затем храните их при температуре 4 °C; для работы в полевых условиях слайды можно транспортировать и хранить при температуре окружающей среды в течение нескольких месяцев><. ПРИМЕЧАНИЕ: CYANOCHIP печатается в тройном формате точечного микрочипа с 3 x 8 идентичными микрочипами на слайде или 9 идентичными массивами в формате 1 x 9 микрочипов. Размер каждой матрицы не должен превышать размеры реакционной камеры для 24-луночной прокладки (обычно 7,5 x 6,5 мм в камере гибридизации 3 x 8).
   5. Прежде чем использовать микрочип для анализа образцов окружающей среды, используйте флуоресцентный иммуноферментный анализ с помощью сэндвич-микрочипа (FSMI) для определения рабочего разведения для каждого антитела на кривой титрования. Для каждого антитела используют стандартную концентрацию соответствующего иммуногена (10³ - 10⁴ клеток/мл) и серийные разведения флуоресцентного антитела (от 1:500 до 1:32 000). Оптимальная концентрация антител соответствует 50% от максимальной интенсивности сигнала, полученной на кривой титрования. Кроме того, необходимо определить чувствительность и специфичность для каждого антитела, как описано в Blanco et al.

6. Получение экстрактов мультианалитов окружающей среды для флуоресцентного микроматричного иммуноферментного анализа (FSMI)

1. Мультианалитический экстракт из жидкого образца
   1. Возьмите 1-100 мл жидкой пробы с помощью стерильного шприца (например, воду с берега водоема); количество пробы в значительной степени зависит от потенциальной концентрации мишеней.
   2. Сконцентрируйте клетки, пропустив пробу воды через поликарбонатный фильтр с размером пор 3 мкм и диаметром 47 мм; для положительного обнаружения желательна концентрация клеток в пределах 10³ - 10⁸ клеток/мл, но фактическая концентрация неизвестна.
   3. Восстановите биомассу, собранную в фильтре, с помощью 1 мл модифицированного трис-буферного физиологического раствора, Tween 20-армированного буфера (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl и 0,1% Tween 20), соскребая ее с помощью шпателя в пробирку объемом 15 мл.
   4. Гомогенизируйте и дезагрегируйте с помощью ручного ультразвукового процессора, как описано в шаге 1.5, или просто путем многократного пипетирования вверх и вниз; это подготовит образец к анализу с помощью микрочипа.
2. Мультианалит экстракт из твердого образца
   1. Взвесьте до 0,5 г твердого образца (например, породы, почвы или отложений) в пробирку объемом 10 мл и добавьте до 2 мл TBSTRR.
   2. Проводите ультразвуковую обработку, погрузив щуп ультразвукового аппарата в трубку, погрузив трубку в водяную баню мощного рупора ультразвукового аппарата или используя ручной ультразвуковой аппарат. Выполняйте не менее 5 циклов по 30 с частотой 30 кГц, останавливаясь на 30 с во время нахождения на льду.
   3. Фильтруйте для удаления песка, глины и других крупных материалов с помощью шприца объемом 10 мл, соединенного с нейлоновым фильтрующим держателем диаметром 10–12 мм и размером пор от 5 до 20 мкм. Протолкните образец через фильтр в пробирку объемом 1,5 мл. Если фильтр пропитался, взбалтируйте суспензию в шприце и отнесите ее в новый; Это подготавливает фильтратный материал для иммунологического анализа (шаг 7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буферная емкость TBSTRR зависит от типа пробы. Важно проводить иммуноферментный анализ сразу после приготовления экстракта из окружающей среды, чтобы избежать влияния ферментативной деградации на анализируемые литы. В качестве альтернативы добавьте ингибиторы протеазы в экстракт окружающей среды и заморозьте при -80 °C до следующего этапа.

7. Флуоресцентный сэндвич-микроматричный иммуноанализ (FSMI)

1. Блокировка ЦИАНОЧИПА
   ПРИМЕЧАНИЕ: Непосредственно перед использованием обработайте напечатанные стекла, чтобы заблокировать все свободные эпоксидные группы на предметном стекле и удалить избыток нековалентно связанных антител.
   1. Погрузите микрочип в 0,5 М Tris-HCl (pH 9) с 5% (масс.v) раствором BSA на чистую поверхность (например, чашку Петри или пробирку объемом 50 мл) с легким перемешиванием с качающейся платформы на 5 мин. В качестве альтернативы положите предметное стекло на каплю вышеуказанного раствора объемом от 100 до 200 мкл так, чтобы пятна микрочипа были обращены к нему. Оставьте на 3 - 5 минут и продолжайте.
   2. Осторожно поднимите предметное стекло с помощью щипцов с пластиковыми наконечниками, старайтесь не касаться зон микрочипов. Устраните избыток жидкости, мягко постучав предметным стеклом по бумажному полотенцу. Погрузите его в 0,5 М Tris-HCl (pH 8) с 2% (w/v) раствором BSA на 30 минут с легким перемешиванием с качающейся платформы.
   3. Высушите предметное стекло, выполнив короткое центрифугирование (200 - 300 x g в течение 1 минуты) с помощью коммерческой микроцентрифуги, адаптированной для предметных стекол микроскопа. Как вариант, высушите предметное стекло, слегка постучав по бумажному полотенцу.
2. Инкубация экстракта мультианалитного образца с помощью микрочипа
   1. Установите предметное стекло в коммерческую кассету для гибридизации микрочипов с 24 лунками для нескольких микрочипов; следуйте инструкциям поставщика.
   2. После сборки предметного стекла и кассеты внесите пипетку до 50 мкл экстракта образца или разведения его в TBSTRR в каждую лунку кассеты.
   3. Повторите шаг 7.2.2 для каждого анализируемого образца.
   4. В качестве пустого контроля пипетку нанесите 50 мкл TBSTRR в буфер по крайней мере в две отдельные лунки кассеты.
   5. Инкубировать при температуре окружающей среды в течение 1 ч с перемешиванием путем пипетирования каждые 15 мин или путем оставления под легким встряхиванием. В качестве альтернативы можно инкубировать в течение 12 ч при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте другие инкубационные прокладки в зависимости от шаблона микрочипа. Время и температура инкубации на шаге 7.2.5 являются эмпирическими параметрами, которые обычно зависят от аффинности и кинетики связывания каждой пары антиген-антитело.
3. стирка
   1. Извлеките образцы, положив кассету на стол и осторожно постучав по чистой впитывающей бумаге.
   2. Промойте лунки, добавив в каждую из них по 150 мкл TBSTRR, и удалите буфер, как указано выше.
   3. Повторите шаг 7.3.2 еще три раза.
4. Инкубация с антителами флуоресцентного детектора
   1. Добавьте 50 мкл смеси антител, содержащей 17 антител против цианобактериального штамма, каждое из которых мечено флуорохромом в TBSTRR с 1% (w/v) BSA. Определяют концентрацию каждого флуоресцентного антитела в смеси (от 0,7 до 2 мкг/мл) путем проведения экспериментов по титрованию каждой пары антиген/антитело.
   2. Инкубировать в течение 1 ч при температуре окружающей среды, как описано на шаге 7.2.5, или в течение 12 ч при 4°С.
5. Вымывание флуоресцентных антител
   1. Удалите флуоресцентные несвязанные антитела, как в шаге 7.3.
   2. Разберите кассету и погрузите предметное стекло в 0,1x PBS (например, в пробирку объемом 50 мл) для быстрого промывания.
   3. Высушите предметное стекло, как показано в шаге 7.1.3.

8. Сканирование на флуоресценцию

1. Отсканируйте предметное стекло на флуоресценцию на максимальном пике флуоресценции излучения для дальнего красного флуоресцентного красителя в сканере на флуоресценцию. Сделайте несколько изображений микрочипов при различных параметрах сканирования, как правило, путем уменьшения значения усиления лазера.
   заметка: Избегайте насыщенных пятен (> 65 000 подсчетов флуоресценции) — они выходят за рамки шкалы и могут привести к ошибкам количественной оценки.

Таблица 1. Список антител (AB) и штаммов цианобактерий, используемых для производства CYANOCHIP.

Код Ab	Иммуноген (штамм)	порядок	естественная среда	Терпимая	Условия культивирования
К1	Anabaena sp.	Носокалес	неизвестный	BG11 и селитра	30 ºC, непрерывный свет
К2	Anabaena sp.	Носокалес	неизвестный	БГ11о	30 ºC, непрерывный свет
К3	Microcystis flosaquae	Chroococcales	планктонный	БГ11	28 ºC, непрерывный свет
К4	Microcystis novacekii	Chroococcales	планктонный	БГ11	28 ºC, непрерывный свет
К5	Microcystis aeruginosa	Chroococcales	планктонный	БГ11	28 ºC, непрерывный свет
К6	Aphanizomenon ovalisporum	Носокалес	планктонный	БГ11о	28 ºC, непрерывный свет
К7	Phormidium sp.	Осцилляторы	Бентических	БГ11	18 ºC, 16-8 фотопериод
К8	Rivularia sp.	Носокалес	Бентических	ЧУ-Д	18 ºC, 16-8 фотопериод
К9	Chamaesiphon sp.	Chroococcales	Бентических	БГ11	18 ºC, 16-8 фотопериод
К10	Лептолингбя боряна	Осцилляторы	Бентических	БГ11	18 ºC, 16-8 фотопериод
К11	Tolypothrix distorta	Носокалес	Бентических	БГ11о	18 ºC, 16-8 фотопериод
К12	Aphanizomenon aphanizomenoides	Носокалес	планктонный	БГ11о	28 ºC, непрерывный свет
К13	Nostoc sp. (Антарктида)	Носокалес	Бентических	БГ11о	13 ºC, 16-8 фотопериод
К14	Anabaena sp.	Носокалес	Бентических	БГ11о	13 ºC, 16-8 фотопериод
К15	Leptolyngbya sp.	Осцилляторы	Бентических	БГ11	13 ºC, 16-8 фотопериод
К16	Tolypothrix sp.	Носокалес	Бентических	БГ11	13 ºC, 16-8 фотопериод
К17	Planktothrix rubescens	Осцилляторы	планктонный	никакой	никакой

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фильтры с диаметром пор 0,22 мм	Многородность	GSWP04700	Для получения иммуногенов
Микроцентрифуга Eppendorf 5424R	Научный центр Фишера		Для получения иммуногенов
Фосфатный буферный раствор (PBS) pH 7,4 (10X)	Thermofisher Scientific	70011036	50 мМ фосфат калия, 150 мМ NaCl, pH 7,4
Ультразвуковой процессор UP50H	Хильшер		Для получения иммуногенов
Полный адъювант Фрейнда	Сигма-Олдрич	Ф5881	Иммунопотенциатор
Неполный адъювант Фрейда	Сигма-Олдрич	Ф5506	Для форс-инъекций
Набор для очистки антител к протеину А	Сигма-Олдрич	PURE1A	Для выделения IgG
Центробежные фильтрующие устройства MWCO<100 KDa	Многородность	UFC510096-96К	Для выделения IgG
Трубки диализные, бензоилированные	Сигма-Олдрич	Д7884-10ФТ	Для выделения IgG
Колонки Illustra Microspin G-50	GE-HealthCare	ГЭ27-5330-02	Для выделения IgG
Реагент Брэдфорд	Сигма-Олдрич	В6916-500 мл	Для количественной оценки концентрации антител
Набор для анализа белка MicroBCA	Термо Сайентиал	No 23235	Для количественной оценки концентрации антител
Белковый буфер 2X	Ватман (Сигма Олдрич)	С00537	Буфер для печати; 30-40% глицерина в 1X PBS с 0,01% Tween 20
Подросток 20	Сигма-Олдрич	П9416	Неионогенное моющее средство
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Сигма-Олдрич	А9418	Контроль за печатью; блокирующий реагент
384-луночный микропланшет	Генетикс	Х6004	Для печати на антителах
Робот-распорядитель для нескольких слайдов	Массивный массив MicroGrid II TAS от Digilab		Для печати на антителах
Стеклянные горки с эпоксидной подложкой	Корпорация Arrayit	VEPO25C	Надежная поддержка печати антител
Alexa Fluor-647 Сукцинимидиловый эфир	Молекулярные зонды	А20006	Флуорохром
Дмсо	Сигма-Олдрич	Д8418	Растворитель фторохрома
Вибрационный встряхиватель Heidolph Titramax	Научный центр Фишера		Для мечения антителами
Колонки Illustra Microspin G-50	здравоохранение	Тел.: 27-5330-01	Для очистки меченых антител
Безопасная запайка коричневая пробирка 0,5 мл	Сарштедт	7,27,04,001	Для хранения меченых антител
Спектрофотометр Nanodrop 1000	Термо Сайентиал		Для количественной оценки концентрации антител и эффективности мечения
Фильтр из поликарбоната размером пор 3 мкм Фильтр диаметром 47 мм	Многородность	TMTP04700	Для концентрирования ячеек
1М раствор Тризмы гидрохлорида pH 8	Сигма-Олдрич	Т3038	Для подготовки ТБСТРР; для блокировки предметных стекол
Хлорид натрия	Сигма-Олдрич	С7653	Для подготовки к TBSTRR
Нейлоновые фильтры 20 μм	Многородность	NY2004700	Для приготовления экстрактов из окружающей среды
Держатели фильтров 10-12 мм	Многородность	SX0001300	Для приготовления экстрактов из окружающей среды
Коктейль ингибиторов протеазы	Сигма-Олдрич	П8340	Для хранения экстрактов в окружающей среде
1М раствор гидрохлорида Тризма pH 9	Сигма-Олдрич	Т2819	Блокировка слайдов
Шейкер для качалки Heidolph Duomax 1030	ВВР		Для блокировки предметных стекол; для инкубационных процессов
Микроцентрифуга VWR Galaxy miniarray	ВВР	С1403-ВВР	Для сушки предметных стекол
Кассета для гибридизации с микрочипами Multi-Well	Корпорация Arrayit	AHC1X24	Кассета на 24 анализа на предметное стекло
Сканер микрочипов GenePix 4100A	Молекулярные приборы		Сканер для флуоресценции
Программное обеспечение GenePix Pro	Молекулярные приборы		Программное обеспечение для анализа и количественной оценки изображений