Иммуноокрашивание клеток, инкапсулированных в 3D гидрогелевую систему

Аннотация

Источник: LeSavage, B. L., et al. Производство эластин-подобных белковых гидрогелей для инкапсуляции и иммуноокрашивания клеток в 3D. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует технику иммуноокрашивания клеток, инкапсулированных в 3D-гидрогель. Гидрогелевую культуру, содержащую нейральные клетки-предшественники, фиксируют, проникают и обрабатывают блокирующим раствором для предотвращения неспецифического иммуноокрашивания. Для связывания специфических белков добавляется первичный коктейль антител, за которым следуют флуоресцентно меченные вторичные антитела и ядерный краситель. Затем образец устанавливается на предметное стекло и рассматривается под конфокальным микроскопом.

Протокол

1. Инкапсуляция клеток в гидрогелях с 3D эластин-подобным белком (ELP)

1. Подготовка силиконовых форм
   1. С помощью биопсийного перфоратора нужного диаметра создайте отверстия в силиконовом листе толщиной 0,5 мм и вырежьте квадрат вокруг каждого отверстия. Повторите для желаемого количества форм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр и толщина форм могут быть отрегулированы в зависимости от конкретного применения и условий культивирования клеток. На практике для клеточных культур размером 50 x 10^{6 клеток}/мл рекомендуются пресс-формы толщиной 0,5 мм с диаметром 4 мм и 5 мм для достаточной экстракции ДНК/РНК и белка соответственно. Для иммуноокрашивания можно использовать 2-миллиметровый биопсийный перфоратор для создания трех смежных отверстий на квадратную форму, чтобы можно было окрашивать три реплики в лунке.
   2. Снимите с помощью пинцета полиэтиленовую пленку с каждой стороны отдельной формы.
      заметка: Избегайте контакта с открытой силиконовой поверхностью, так как загрязнение может снизить эффективность плазменного склеивания в будущем.
   3. С помощью пинцета расположите одинаковое количество голых силиконовых форм и стеклянных покровных стекол (No 1, диаметр 12 мм) в чередующиеся ряды на перевернутой крышке 48-луночной пластины. После завершения накройте крышку 48-луночного планшета, чтобы избежать загрязнения.
   4. Кислородной плазмой обрабатывают всю крышку 48-луночного планшета (т.е. формы и предметные стекла). Сразу после этого с помощью щипцов переверните силиконовую форму на соседнюю стеклянную покровную крышку. Плотно надавите на форму, чтобы обеспечить склеивание. Дайте формочкам инкубироваться при комнатной температуре в течение 1 ч.<бр/> заметка: Продолжительность лечения кислородной плазмой будет варьироваться в зависимости от используемого инструмента. Типичными условиями для нашего прибора являются рабочее окно давления газа в пределах 0,3-4 мбар, расход газообразного кислорода при 20^см3/мин и воздействие плазмы на образец в течение 10-20 с.
   5. Простерилизовать формы методом автоклавирования. Хранить формы при комнатной температуре в стерильной среде до использования.
      заметка: Формы могут храниться на этом этапе неограниченное время.
2. Приготовление исходного раствора эластиноподобного белка
   1. Удалите лиофилизированный ELP из хранилища при температуре 4 °C. Нагрейте белок до комнатной температуры перед открытием пробирки, чтобы убедиться, что при повторном использовании на белке не образуется конденсат.
   2. Растворите ELP в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS) при 4 °C с постоянным перемешиванием (т.е. вращением) в течение ночи.
      заметка: Концентрация стокового раствора ELP будет дополнительно разбавлена с добавлением раствора сшивающего агента в заданном пользователем объемном соотношении. Например, для конечной концентрации ELP 3% (w/v) приготовьте стоковый раствор ELP 3,75% (w/v), который будет разбавлен в объемном соотношении 4:1 раствор ELP:раствор сшивающего агента. Отрегулируйте концентрацию по мере необходимости для желаемого применения.
   3. Стерильный фильтр ELP стокового раствора с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм. Храните ELP на льду, когда он не используется.
3. В шкафу биобезопасности перенесите стерильные формы с помощью стерильного пинцета на 24-луночный планшет для культуры тканей.
4. Приготовление стокового раствора тетракис(гидроксиметил)фосфония хлорида (ТГХК)
   1. Разведите THPC в DPBS непосредственно перед использованием. Отрегулируйте концентрацию раствора THPC в соответствии с конечной концентрацией ELP и желаемым коэффициентом сшивания.
      заметка: Для протокола конечная концентрация ELP в размере 3% (w/v) будет получена путем смешивания исходного раствора ELP с раствором THPC в объемном соотношении 4:1. При необходимости отрегулируйте.
   2. Добавьте 2,6 мкл раствора ТГПК (80% в воде) к 997,4 мкл DPBS.<бр/> заметка: Эта концентрация ТГПК соответствует стехиометрическому соотношению гидроксиметиловых групп на ТГПК и первичных аминов на белке ELP в соотношении 1:1 при смешивании растворов в описанном объемном соотношении 4:1 для получения конечного 3% (w/v) гидрогеля ELP. Раствор THPC вязкий, и капли раствора могут прилипать к боковой стороне наконечника пипетки. Для получения точных концентраций избегайте попадания таких капель при разведении в DPBS. Продуйте контейнер со складом THPC газообразным азотом, чтобы предотвратить окисление фосфина и инактивацию сшивающего агента.
   3. Вихревой раствор перемешать и держать на льду.
   4. Стерильно отфильтровать стоковый раствор THPC с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм. Дополнительно разбавьте исходный раствор THPC стерильным DPBS для достижения более низких стехиометрических коэффициентов сшивания (например, 0,5:1 или 0,75:1).
      заметка: ТГПК чувствителен к кислороду, и разбавленный раствор следует использовать в течение нескольких часов после приготовления.
5. Диссоциируйте клетки путем инкубации с трипсином-ЭДТА в одноклеточную суспензию, гранулируйте клетки и подсчитайте клетки, повторно суспендированные в среде, с помощью гемоцитометра><. заметка: Точные протоколы для этого шага будут в значительной степени зависеть от желаемого типа клетки и ее применения. Для нейронных клеток-предшественников, используемых в этом протоколе, проводили инкубацию 0,025% трипсина-ЭДТА при комнатной температуре в течение 1,5 мин. Клетки гранулировали при 200 х г в течение 2 мин. Для повышения жизнеспособности клеток клетки следует подвешивать в нормальных условиях среды. Типичные плотности клеток, используемые для инкапсуляции клеток, варьируются от 1 до 50 x 10^{6 клеток/}мл конечного объема гидрогеля. При необходимости отрегулируйте.
6. Поместите желаемое количество клеток в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
7. Центрифугируйте клетки при температуре ~200 x g в течение 3 мин. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и держите клеточную гранулу на льду.
   заметка: Крайне важно полностью аспирировать всю надосадочную жидкость, чтобы смягчить дальнейшее разведение сшивающего агента ELP и THPC. Конкретная скорость центрифугирования зависит от типа ячейки.
8. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в исходном растворе ELP таким образом, чтобы объем составлял 80% от конечного объема (при соотношении 4:1 раствор ELP:раствор THPC). Пипетку перемешайте 20-25 раз до получения однородной смеси клеток и ELP.
   заметка: Избегайте захвата нижней части трубки, чтобы предотвратить повышение температуры и последующий фазовый переход ELP. Для каждой формы толщиной 2 мм с тремя репликами требуется 7,5 мкл конечного объема (т. е. 6 мкл стокового раствора ELP и 1,5 мкл стокового раствора THPC), разделенного поровну на 3 отверстия (т. е. 2,5 мкл конечного объема на отверстие). Для форм диаметром 4 и 5 мм требуется конечный объем 7,5 мкл и 15,5 мкл соответственно.
9. Добавьте стоковый раствор THPC в суспензию ячейки/ELP для получения оставшихся 20% конечного объема. Пипеткой перемешайте 20-25 раз, чтобы получилась однородная смесь.
Немедленно внесите
10. соответствующие конечные объемы смеси клеток/ELP/THPC в каждую форму круговыми движениями. Повторите для всех форм.
11. Образцы инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин, после чего проводят дополнительную инкубацию при 37 °C в течение 15 мин.<бр/> заметка: Первый инкубационный период будет способствовать первоначальному сшиванию гидрогеля перед повышением температуры выше нижней критической температуры раствора ELP (LCST) и индуцированием его термической сегрегации.
12. Медленно добавляйте 750 мкл теплой среды для клеточных культур в каждую лунку 24-луночного планшета, избегая разрушения гелей.
13. Инкубируйте гидрогели при температуре 37 °C в течение 7 дней.
    заметка: Полная смена среды рекомендуется каждые 1-2 дня в зависимости от типа клеток. Чтобы ограничить нагрузку на гель, используйте стеклянную пипетку Пастера, прикрепленную к наконечнику пипетки объемом 200 мкл, при аспирации среды из лунки.

2. Иммуноцитохимия клеток в 3D гидрогелях ELP

1. Приготовьте раствор для фиксации, смешав 10 мл 16% параформальдегида (PFA) с 30 мл DPBS. Нагрейте раствор до 37 °C.
2. Отсадите среду из 24-луночного планшета и аккуратно промойте 1 мл DPBS.
3. Добавьте по 750 μл раствора фиксации в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. Не используйте инкубатор для тканевых культур, чтобы избежать загрязнения других культур парами PFA.
4. Осторожно отсасывайте фиксирующий раствор из каждой лунки, сбрасывая PFA в соответствующий контейнер для опасных отходов.
   осторожность: Воздействие PFA может вызвать раздражение кожи и глаз. Надевайте перчатки/защитные очки и работайте в вытяжном шкафу для химических веществ.
5. Добавьте 1 мл DPBS в каждый образец. Немедленно отасуньте DPBS и выбросьте в контейнер для отходов PFA.
6. Дважды промойте образцы 1 мл DPBS в течение 10 минут каждый.
   заметка: Образцы могут храниться в DPBS при температуре 4 °C в течение недели после герметизации пластины парапленкой.
7. Пермеабилизируйте каждый образец 750 мкл раствора для пермеабилизации (100 мл DPBS и 0,25 мл Triton X-100; PBST) в течение 1 ч при комнатной температуре на коромысле со скоростью 15 об/мин.
8. Отсадите PBST и добавьте 750 μл блокирующего раствора (95 мл PBS, 5 г бычьего сывороточного альбумина (BSA), 5 мл сыворотки и 0,5 мл Triton X-100) в каждый образец. Инкубировать при комнатной температуре в течение 3 ч на коромысле при 15 об/мин.<бр/> заметка: Блокирующий раствор должен содержать сыворотку от вида-хозяина, у которого были подняты вторичные антитела (например, козы, осла), и стерильно фильтровать через фильтр 0,22 мкм перед использованием.
9. Приготовьте раствор для разведения антител (97 мл DPBS, 2,5 г BSA, 2,5 мл сыворотки (от того же вида хозяина, из которого получен EPL) и 0,5 мл Triton X-100). Разбавьте первичное антитело с помощью раствора для разведения антител и добавьте 500 мкл раствора в каждый образец. Запечатайте пластину парапленкой и выдерживайте в течение ночи при температуре 4 °C на коромысле.
   заметка: Первичные антитела Nestin и Sox2 разводили в соотношении 1:400 в растворе для разведения антител от исходной концентрации производителя.
10. Отасуньте раствор антитела из каждого образца и промойте образцы PBST в течение 60 мин при комнатной температуре на коромысле со скоростью 15 оборотов в минуту. Повторите шаг стирки 3 раза.
11. Разведите вторичные антитела и 5 мг/мл DAPI (1:2000) с помощью раствора для разведения антител и добавьте 500 мкл раствора в каждый образец. Накройте планшет на 24 лунки алюминиевой фольгой и выдерживайте в течение ночи при температуре 4 °C на коромысле.
    заметка: Поскольку вторичные антитела чувствительны к свету, образцы должны быть защищены от фотообесцвечивания на всех последующих этапах. Вторичные антитела против мышей коз и коз против кроликов разводили в соотношении 1:500 в растворе разведения антител от исходной концентрации производителя.
12. Отасканируйте раствор антитела из каждого образца и промойте образцы PBST в течение 30 минут при комнатной температуре на коромысле. Повторите шаг стирки 3 раза.
13. Поместите каплю жестко закрепленного монтажного материала на поверхность предметного стекла. С помощью щипцов удалите излишки раствора из формы, слегка промокнув край формы бумажным полотенцем. Осторожно поместите форму вверх дном на монтажный носитель и не допускайте образования пузырей.
14. Дайте монтажной среде застыть в течение 48 часов при комнатной температуре. Храните образцы при комнатной температуре или 4 °C. Дайте монтажной среде полностью застыть в течение 48 часов перед получением изображения, так как показатель преломления среды будет меняться в процессе затвердевания. Запечатайте образцы на предметном стекле стеклянной крышки прозрачным лаком для ногтей, чтобы уменьшить загрязнение или перемещение образца.
15. Визуализируйте образцы с помощью конфокального микроскопа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инкапсуляция клеток в гидрогелях 3D ELP
Шприцевые фильтры 0,22 мкм	Многородность	SLGV004SL
Силиконовый лист толщиной 0,5 мм	Наука электронной микроскопии	70338-05
24-луночные планшеты для культивирования тканей	Корнинг	353047
Одноразовый пуансон для биопсии (2 мм)	Интегра Милтекс	33-31
Одноразовый пуансон для биопсии (4 мм)	Интегра Милтекс	33-34
Одноразовый пуансон для биопсии (5 мм)	Интегра Милтекс	33-35
Фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко (DPBS)	Корнинг	21-031-СМ
No 1 Стеклянные покровные стекла 12 мм	Thermo Fisher Scientific	Тел.: 12-545-80
Тетракис(гидроксиметил)фосфония хлорид (ТГПК)	Сигма-Олдрич	404861-100МЛ
0,5% Триспин/ЭДТА	Термо Фишер	15400054
Иммуноцитохимия клеток в 3D гидрогелях ELP
16% (по мас.) параформальдегида (PFA)	Науки электронной микроскопии	15701
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Рош	3116956001
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид)	Молекулярные зонды	Д1306
Сыворотка ослика	Биологические лаборатории Лампайр	7332100
Вторичное антитело против мышей у коз (AF488)	Молекулярные зонды	А-11017
Вторичное антитело против кролика у козы (AF546)	Молекулярные зонды	А-11071
Козья сыворотка	Gibco	16210-072
Первичное антитело к мышиному нестину	BD Pharmingen	556309
Мышиное Sox2 Первичное антитело	Технология клеточной сигнализации	23064С
лак	Науки электронной микроскопии	72180
Тритон Х-100	Сигма-Олдрич	Х100-100МЛ
Vectashield Hardset Монтажный средний	Векторные лаборатории	Н-1400

гг. гг.