$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Конъюгация пептидов антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Холевая кислота, связанная с NLS (ChAcNLS), может быть синтезирована на любом коммерческом производителе пептидов или на платформе для синтеза пептидов, аффилированной с университетом.
- В микроцентрифужной пробирке объемом 1,7 мл приготовьте 10 мг/мл (~1 мг общего антитела) раствор 7G3 в фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,6.
- Сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC) растворить в диметилсульфоксиде (ДМСО) в концентрации 5-10 мМ. Тщательное вортексирование раствора лучше всего подходит для достижения полного растворения.
- Добавьте в пробирку, содержащую 7G3, растворенный раствор серы-SMCC (обычно от 5 до 20 мкл в зависимости от желаемого молярного соотношения сульфо-SMCC-к 7G3). Рекомендуется проводить тестирование соотношения сульфо-SMCC-7G3 10-, 25- и 50-к-1. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Очистите и концентрируйте малеимид-дериватизированный 7G3 с помощью ультрафильтрационного устройства и буферного обмена в PBS, pH 7,0. Центрифугируйте при давлении 8 000 x g в течение примерно 5 минут. Отбросьте проточный поток и заполните PBS, pH 7,0 и снова центрифугируйте.
- Выполните это 7-8 раз, чтобы полностью заменить буфер. Восстановите концентрированный белок 7G3, поместив фильтрующее устройство вверх дном в чистую микроцентрифужную пробирку. Центрифуга в течение 2 мин при 1 000 x g. Объем восстановления должен составлять примерно 0,3 мл.
- В пробирку, содержащую активируемый малеимидом 7G3, добавьте 2-кратный молярный избыток ChAcNLS относительно соотношения сульфо-SMCC-7G3, использованного на предыдущем этапе, и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. Например, если использовалось соотношение сульфо-SMCC-7G3 10 к 1, то используйте соотношение ChAcNLS-к-7G3 20 к 1. Общий объем не должен существенно изменяться. <чел/>
заметка: Хотя ChAcNLS не вызывает осаждения в процессе конъюгации, это возможно, что может произойти с другими пептидами. Наблюдайте за трубкой во время реакции на наличие признаков осаждения, которое, скорее всего, вызвано гидрофобностью пептидов. В этих случаях, возможно, стоит вернуться к интересующему нас пептиду, чтобы внести изменения в конструкцию для обеспечения повышенной гидрофильности.
- Концентрируйте 7G3-ChAcNLS с помощью ультрафильтрационного устройства до желаемой концентрации и буферного обмена при PBS pH 7,4 (см. шаг 1.4). Выход восстановления общего белка должен составлять ≥ 75% от исходного исходного материала.
- Проведите электрофорез в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) для оценки сконструированных кандидатов 7G3-ChAcNLS с использованием 12% полиакриламидного геля (обеспечивает достаточное разделение сопряженных тяжелых и легких цепей ChAcNLS с неконъюгированными цепями). Смешайте 10 мкг 7G3-ChAcNLS в загрузочном буфере PAGE, содержащем 2 мкл β-меркаптоэтанола, и загрузите в лунку.
- Установите соответствующее напряжение (120 В в течение 1 ч для 12% геля) и запустите электрофорез. Остановите электрофорез, когда фронт красителя Кумасси достигнет дна геля.
заметка: Не допускайте, чтобы краситель Coomassie спереди стекал с геля.
- Удалить гель из аппарата для электрофореза и промыть раствором, содержащим 10% v/v ледяной уксусной кислоты и 20% v/v метанола.
- Сфотографируйте гель и с помощью линейки измерьте расстояние (см), которое мигрировало для стандартов и конъюгатов 7G3. Рассчитайте значение коэффициента удержания (Rf), которое представляет собой расстояние миграции, деленное на длину геля (от места загрузки белка к фронту миграции Кумасси). Построите график молекулярной массы (MW) в log в зависимости от значений Rf для каждого стандарта белка и экстраполируйте размер конъюгатов 7G3.
- Рассчитайте количество пептидов на антитело, разделив разницу в МВт между конъюгатами 7G3 и немодифицированным 7G3 на 1768,5 г/моль (МВт ChAcNLS).
- Сделайте цифровые снимки окрашенного геля Кумасси и выполните денситометрический анализ. На этом этапе выбор ведущего кандидата может быть основан на АС с максимальным числом молекул ChAcNLS, не содержащим значимых агрегатных веществ.
2. Конфокальная микроскопия для оценки внутриклеточного накопления
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно проверить клеточную селективность внутриклеточного накопления пептид-модифицированных mAb перед разработкой составов с полезной нагрузкой, представляющей интерес. Поскольку было показано, что Tat также имеет склонность к неспецифическому проникновению в клетки, стоит сначала проанализировать внутриклеточное накопление и клеточную селективность, прежде чем предпринимать дорогостоящие этапы разработки с дорогостоящей полезной нагрузкой. По этой причине Процедура 1 должна также модифицировать специфичные для изотипа нерелевантные контрольные мАТ. В остальной части протокола мы будем работать с AC, модифицированными 10 молекулами ChAcNLS на антитело. Схема, включающая ключевые шаги для процедур 2 и 3, показана на рисунке 1.
ВНИМАНИЕ: Этот этап протокола включает в себя обращение с параформальдегидом и манипуляции с ним. Пожалуйста, следуйте инструкциям производителя при обращении.
- Обрабатывайте клетки-мишени TF-1a 200 нМ 7G3-ChAcNLS, включая модифицированные контрольные mAb. Инкубировать 5 x 106 антиген-положительных клеток с конъюгатами в течение 1 ч при 37 °C.
- Через 1 час удалите надосадочную жидкость и умойтесь 1 мл 3x в ледяном PBS. Добавьте свежую среду и инкубируйте еще час при температуре 37 °C.
- По истечении дополнительного часа удалите надосадочную жидкость и промойте 3 раза в 1 мл ледяного PBS. Добавьте 0,5 мл PBS, содержащего 0,25% трипсина и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) при 37 °C в течение 3-30 мин.
заметка: Во время первоначального пилотного тестирования рекомендуется не трипсинизировать клетки, чтобы определить различия в внутриклеточном накоплении АС. Этот протокол способствует использованию трипсина, и мы демонстрируем, как это улучшает оценку эффективности внутриклеточного накопления различных кандидатов в АС.
- Проверьте разное время инкубации, визуально проверив, все ли клетки отделяются. Кроме того, инкубируют аликвоты клеток с растворами для окрашивания жизнеспособности и проводят проточный цитометрический анализ, как описано ранее.
- Нейтрализовать трипсин 1,5 мл среды клеточной культуры RPMI 1640/10% фетальной бычьей сыворотки. Центрифугируйте ячейки при 500 x g в течение 5 минут, удалите надосадочную жидкость и промойте 3 раза в 0,5 мл ледяного PBS.
- Зафиксировать клетки в 0,5 мл PBS, содержащем 1% параформальдегида и 1% сахарозы, на льду в течение 30 мин. Промыть клетки 3 раза в 0,5 мл ледяного PBS и центрифугировать при 250 x g в течение 5 мин. Пермеабилизировать клетки в 0,5 мл PBS, содержащем 0,15% Triton X-100, в течение 5 мин на льду. Промойте ячейки в ледяном PBS и повторите центрифугирование.
- Суспензируйте клетки в 0,1 мл PBS, содержащем 2 мкг/мл (или рекомендованную производителем концентрацию) антимышиного (специфичного для изотипа) вторичного поликлонального антитела Fc, конъюгированного с AlexaFluor 647, в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
- Центрифугируйте при 250 x g в течение 5 минут и промойте ячейки 3 раза в 0,5 мл ледяного PBS. Суспензировать клетки в 0,5 мл PBS.
пауза: Клетки можно хранить в холодильнике.
заметка: Важно выбрать вторичное антитело, которое распознает правильный изотип интересующего mAb. AF647 выбран из-за его дальнего инфракрасного излучения, которое не препятствует окрашиванию ядра йодидом пропидия (PI).
- Добавьте ПИ в концентрацию 10 мкг/мл в емкость с клетками. Далее закрепите 1 x 105 ячеек на предметные стекла с помощью монтажного материала и накройте стеклянным покровным стеклом.
- Исследуйте клетки с помощью масляного иммерсионного объектива Plan Apo 60X NA 1.42 на инвертированном лазерном сканирующем конфокальном микроскопе. Детектирование флуоресценции PI с помощью аргонового лазера с длиной волны 488 нм и набора спектральных сканирующих призм для 600 - 650 нм. Для флуоресценции AF647 используйте гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 нм и набор спектральных сканирующих призм для 650 - 700 нм. Последовательный сбор флуоресцентных излучений от PI и AF647.
заметка: Используйте одну и ту же настройку при оценке и сравнении ячеек. Тем не менее, вам придется изменить настройки для трипсинизированных клеток по сравнению с нетрипсинизированными ячейками.
- Используйте программное обеспечение для микроскопа для получения изображений. Собирайте изображения с помощью последовательных горизонтальных оптических участков размером 1 024 x 1 024 пикселей с 2-кратным усреднением линий, сделанных с интервалом 0,5 мкм по всей толщине ячейки. Представьте изображения в виде наложенных z-проекций из четырех последовательных срезов с максимальной интенсивностью флуоресценции.
- Анализируйте клетки с помощью программного обеспечения для микроскопа. Запишите характер клеточного распределения конъюгатов. В частности, оцените, является ли внутриклеточная флуоресценция в цитоплазме групповой и вблизи поверхности клетки или диффузной и однородной. Также оцените относительную интенсивность флуоресценции на клетку.
