Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка катетера перед стереотаксической хирургией
- Вырежьте катетеры PE50 (длиной 6 см), которые будут использоваться для подключения канюли к осмотическим насосам (см. рисунок 1). Заполните катетеры PE50 искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF) и загерметизируйте оба конца катетеров. Держите катетер при температуре 4 °C до использования.
2. Имплантация канюли методом стереотаксии
- Проводите операцию в стерильных условиях. Стерилизуйте все хирургические инструменты и материалы путем автоклавирования. Тщательно очистите стереотаксический аппарат и рабочую зону и продезинфицируйте 70% раствором этанола. Наденьте хирургическую маску, чепчик для волос и стерильные перчатки.
- Обезболивайте крыс путем внутрибрюшинного введения (в/в) раствора кетамина и ксилазина (100 мг/кг и 10 мг/кг соответственно). Подтвердите анестезию, проверив движение после легкого ущипывания пальцев ног.
- Введите нестероидный противовоспалительный препарат (мелоксикам; 1 мг/кг) подкожно (подкожно) животному, находящемуся под наркозом, не менее чем за 30 минут до операции.
- Побрейте голову животного с помощью машинок для стрижки и трижды продезинфицируйте кожу раствором хлоргексидина глюконата 2% и изопропилового спирта 2%. Нанесите ветеринарную офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время пребывания под анестезией.
- Поместите животное на стереотаксическую рамку с ушными планками. Закрепите одну канюлю на кронштейне держателя стереотаксической рамы. Введите (под/к) местный анестетик (бупивакаин (1,5 мг/кг) и лидокаин (1,5 мг/кг) в верхнюю часть головы. Анестезия поддерживается в течение всей процедуры путем установки носового конуса, доставляющего 3% изофлуран. Все операционное поле должно быть задрапировано, но здесь это сделано не для того, чтобы лучше продемонстрировать технику.
- Сделайте скальпелем надрез в 3 см на макушке головы. Установите 4 зажима вокруг разреза, чтобы череп оставался чистым. С помощью ножниц с круглым концом сделайте карман (2 х 2 см2) под кожей между лопатками животного.
- Соскребите надкостницу черепа лезвием. Приложите марлевую салфетку к черепу, если он кровоточит.
- Убедитесь, что череп плоский и хорошо выровнен на стереотаксической раме. Чтобы убедиться, что череп плоский, проверьте координаты высоты в брегме и лямбде. Возьмем координаты брегмы, которые будут использоваться в качестве точки отсчета.
- Начиная с брегмы, рассчитайте координаты двух направляющих канюль, которые будут имплантированы двусторонне в гиппокамп (переднезадняя: - 0,42 см; медиолатеральная: ± 0,30 см; дорсовентральная: - 0,28 см по атласу мозга крысы Паксиноса и Уотсона). Обозначьте положение канюли маркером.
- Просверлите отверстие (0,5 мм) в черепе в точке имплантации обеих канюль. Просверлите два других отверстия примерно на 5 мм выше и ниже этих точек, чтобы вставить винты, которые будут затвердевать канюлю при наложении стоматологического цемента.
- Отрежьте скальпелем один конец катетера, ранее заполненного ХКСФ, и вставьте его в угловой рукав канюли. Зафиксируйте первую канюлю стоматологическим цементом. Избегайте наложения стоматологического цемента вокруг места на второй канюле.
- Дайте стоматологическому цементу высохнуть в течение 2 - 3 минут, затем снимите держатель с первой канюли, и зафиксируйте в нем вторую канюлю. Повторите шаги 2.11 и 2.12. Наденьте фиктивную канюлю на обе направляющие канюли. Убедитесь, что манекен и направляющая канюля имеют одинаковую длину, чтобы предотвратить инфильтрацию тканей и блокировку канюли.
- Свободный конец обоих катетеров вставьте в карман, предварительно сделанный между лопатками животного. Снимите зажимы и прострочите кожу шовной нитью 4-0,<бр/>
заметка: Верхняя направляющая канюля должна быть доступна для предстоящих инфузий Aβo.
- Извлеките животное из стереотаксической рамки и посадите его обратно в клетку. Во время послеоперационного восстановления поместите клетку на одеяло с подогревом воды, пока животное не проснется. Клетка должна быть частично на подушке, чтобы крыса могла спастись от жары в случае необходимости. Постоянно наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
- Верните крыс в помещение для животных для восстановления после операции в течение 10 дней под тщательным наблюдением.
заметка: Не стоит возвращать животное, перенесшее операцию, в компанию других животных до полного выздоровления. Мелоксикам (1 мг/кг) назначают один раз в сутки в течение двух дней после операции для снятия боли.
3. Установка осмотического насоса
- За сутки до установки наполните осмотические насосы антителом 6E10 (1 мг/мл; 100 μл) и контролируйте антитела IgG1 (1 мг/мл; 100 μл) в соответствии с инструкциями производителя в стерильных условиях. Для активации насосов держите в стерильной дистиллированной воде при температуре 37 °C в течение ночи.
- Обезболить крыс изофлураном 3% с установкой осмотических насосов (0,5 мкл/ч в течение 7 дней). Побриться между лопатками и продезинфицировать кожу раствором хлоргексидина глюконата 2% и изопропилового спирта 2%. Сделайте разрез скальпелем на расстоянии 2 см между лопатками, чтобы найти катетеры PE50, подключенные к направляющей канюле.
- Разрежьте скальпелем конец катетеров PE50, содержащих стоматологический цемент. Подсоедините осмотические насосы к катетерам PE50 и добавьте немного стоматологического цемента на стык насоса и катетера, чтобы закрепить соединение.
Плотно - прошейте кожу шовной нитью 4-0. Посадите животное обратно в клетку на грелку для воды. Наблюдайте, как животное быстро просыпается от изофлурановой анестезии (около 5 мин).
заметка: Операция занимает примерно от 5 до 10 минут.
4. Инфузии Aβo у бодрствующих и свободно передвигающихся крыс
- Приготовьте раствор Aβo (0,2 мкг/мкл). Дайте Aβo динамически и самопроизвольно агрегироваться в течение 1 часа при комнатной температуре перед инфузией.
- Установите два шприца по 10 мкл на инфузионный насос. Наполните шприцы 5 μл стерильной дистиллированной воды. Разрежьте скальпелем два катетера PE50 примерно до 60 см в длину. Наполните оба катетера стерильной дистиллированной водой с помощью шприцов объемом 1 мл и игл 21G.
- Держите шприцы объемом 1 мл на одном конце катетера, а другой конец подсоедините к шприцам Hamilton. Извлеките шприцы объемом 1 мл и убедитесь, что внутри катетеров нет пузырьков воздуха.
- Вставьте внутреннюю канюлю в конец катетеров PE50. С помощью стерильной дистиллированной воды заполните внутреннюю канюлю, подключенную к катетерам PE50, до 1 мкл на шприцах Hamilton. Создайте пузырь воздуха, оттянув поршни назад до 2 μл.
- Смешайте раствор Aβo, пипетируя вверх и вниз с помощью наконечника с минимальным прилипанием. Избегайте образования пузырьков во время смешивания. Заполните обе внутренние канюли 1,5 мкл раствора Aβo, оттягивая поршни до 3,5 мкл.
- Проведите линии маркером до и после пузырька воздуха в обоих катетерах. Это служит контрольной точкой для продолжающейся инфузии. Для инфузии поднесите клетку к инфузионному насосу и снимите с него крышку.
- Уложите крысу в уютное кресло и плотно соскребите руку обнимателя вокруг ее шеи, чтобы обездвижить голову крысы. Извлеките пустышку из двух направляющих канюль. Вставьте предварительно подготовленную внутреннюю канюлю в направляющую канюлю. Убедитесь, что они полностью вставлены и хорошо закреплены на основании направляющей канюли.
- Освободите крысу от уюта и посадите обратно в клетку, чтобы ограничить стресс от соперничества. Внимательно следите за тем, чтобы катетеры не скручивались друг с другом и инфузия проводилась правильно.
- Включите инфузионный насос. Введите 1 мкл раствора Aβo со скоростью 0,1 мкл/мин (10 мин). Во время инфузии убедитесь, что поршень шприца перемещается от 3,5 мкл до 2,5 мкл и что пузырь воздуха в обоих катетерах PE50 движется непрерывно.
- Оставьте внутреннюю канюлю на месте еще на 5 минут после инфузии, чтобы обеспечить эффективную диффузию раствора Aβo. Верните крысу обратно в объятие, чтобы удалить внутреннюю канюлю и закрытую направляющую канюлю, чтобы предотвратить рефлюкс введенного раствора. Используйте фиктивную канюлю, которая останавливается непосредственно перед угловым рычагом канюли. Верните животное в клетку.
- Повторяйте инфузию Aβo один раз в день в течение 6 дней подряд. Усыпьте животное путем обезглавливания.
