Обнаружение и измерение пептидов мишеней с помощью емкостного иммунозондового биосенсора

Аннотация

Источник: Kluge, N. et al., Измерение динамики нейропептидов in vivo с помощью емкостного иммунозонда в сердце свиньи.J. Vis. Exp.(2022).

Это видео демонстрирует метод обнаружения и количественного определения пептидных трансмиттеров с помощью емкостного иммунозондового биосенсора. Функционализированный электрод, покрытый антителами, взаимодействует с интересующими его пептидами, что приводит к изменению сигнала, что позволяет точно измерять и обнаруживать пептиды.

Протокол

1. Изготовление емкостных иммунозондов и функционализация

1. Отрежьте платиновую проволоку длиной 25 см с покрытием перфторалкокси (PFA) (см. Таблицу материалов) и снимите скальпелем примерно 5 мм покрытия PFA с одного конца, стараясь не порезать платиновую проволоку.
2. Вставьте зачищенный конец платинового провода в позолоченный соединительный контакт диаметром 1 мм и сожмите зубья соединительного контакта вокруг зачищенного конца платинового провода с помощью плоскогубцев с игольчатым наконечником (см. Таблицу материалов).
3. Припаяйте платиновый провод к позолоченному контакту разъема. Будьте осторожны, чтобы не использовать чрезмерное количество припоя.
4. Приготовьте раствор дофамина путем растворения 50 мг дофамина HCl в 50 мл 10 мМ фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 6,0) путем перемешивания.
5. Как только дофамин полностью растворится, поместите кончик платиновой проволоки в сосуд, содержащий только что приготовленный PBS, обогащенный дофамином. Вставьте золотой соединительный штифт в канал головной сцены (см. Таблицу материалов).
6. Подсоедините дисковый электрод из хлорида серебра (AgCl) (заземляющий электрод, см. Таблицу материалов) к каналу заземления в головном устройстве. Поместите диск AgCl в сосуд, содержащий PBS с добавлением дофамина и платиновую проволоку; Будьте осторожны, погружайте в воду только дисковый электрод, а не провод любой длины или припой. Перед началом работы подсоедините проводной шунт к опорным каналам головного дилижанса.
7. Откройте программное обеспечение для интерактивного сбора данных (см. Таблицу материалов). Подготовить протокол командного потенциала пилообразного электроосаждения со следующими параметрами: пусковой потенциал = −0,6 В; конечный потенциал = +0,65 В; скорость сканирования = 0,04 В∙^с-1; Продолжительность осаждения = 420 с. Начните протокол осаждения полидофамина, убедившись, что все провода подключены правильно.
8. После завершения осаждения полидофамина извлеките измельченную гранулу AgCl и наконечник платиновой проволоки из сосуда, стараясь не повредить кончик электрода из платиновой проволоки. Поместите кончик проволоки в микротрубку, содержащую PBS (pH 7,4), на 2-5 минут по мере приготовления раствора антитела; Убедитесь, что наконечник провода не соприкасается с боковыми сторонами или дном микротрубки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор антитела может быть получен во время отложения полидофамина; однако не следует пропускать перенос платиновой проволоки из дофаминсодержащего сосуда в микротрубку PBS после осаждения полидофамина.
9. Приготовьте раствор антитела. Объедините представляющее интерес антитело с PBS (pH 7,4) в соотношении 1:20 в сосуде соответствующего размера (например, микропробирке).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использованное здесь моноклональное антитело против нейропептида Y (анти-NPY) (см. Таблицу материалов) было аликвотировано в концентрации 1 мг/мл; Примером препарата антитела в данном случае может быть 4 мкл антитела на 76 мкл PBS.
10. Замочите полидопамин-осажденный наконечник платинового электрода в растворе антитела минимум на 2 ч при комнатной температуре, снова убедившись, что наконечник платиновой проволоки находится во взвешенном состоянии в растворе и не опирается на внутреннюю поверхность микротрубки><. ПРИМЕЧАНИЕ: Недавнее внедрение этого метода отдает предпочтение использованию электрода из платиновой проволоки сразу после этого шага вместо влажного или сухого хранения для последующего использования.
11. После замачивания в растворе антитела кратковременно промойте только что функционализированный наконечник емкостного иммунозонда (зонда CI) в PBS (pH 7,4). Теперь зонд готов к использованию.

2. Экспериментальная установка для обнаружения in vitro и измерения пептида

1. Поместите функциональный наконечник датчика CI в проточную камеру, стараясь не повредить наконечник электрода, так как это может привести к повреждению сенсорного наконечника зонда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проточная камера была создана путем заливки силиконового эластомера (см. Таблицу материалов) в чашку для культуры диаметром 35 мм с удлиненным яйцевидным заполнителем в центре чашки. После затвердевания из эластомера удаляют яйцевидную форму. Затем в камеру наплавляют трис-буферизованным физиологическим раствором (TBS) и обеспечивают скорость потока 3 мл/мин. Убедитесь, что приток и выток поддерживают уровень жидкости в камере таким образом, чтобы не наблюдалось приливного действия суперфузата. Поток должен оставаться на месте до тех пор, пока используется зонд CI.
2. Перед первым экспериментальным испытанием выполните стандартный прогон TBS для кондиционирования зонда CI. Настройте следующий протокол командного напряжения: положительный потенциал шага = +100 мВ; отрицательный ступенчатый потенциал = −5 мВ; длительность шага = 20 мс; Продолжительность сбора = 600 с. < руб. /> ПРИМЕЧАНИЕ: Важно предусмотреть балансировку зонда на начальной фазе цикла командного потенциала перед сбором данных.
3. Создать раствор интересующего пептида с использованием того же TBS для поддержания состава суперфузата. Установите систему коллектора, в которой суперфузат можно переключать между TBS и TBS с добавлением пептидов без введения пузырьков в систему трубок или проточную камеру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовался синтетический пептид NPY свиней (см. Таблицу материалов).
4. Настройте протокол сбора данных пептидного зондирования с использованием стандартных параметров TBS (см. шаг 2.2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой реализации продолжительность каждого экспериментального испытания составляла 360 с (120 с TBS, 120 с TBS с добавлением пептидов, 120 с TBS).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дисковый электрод AgCl	Warner Instruments (Холлистон, Массачусетс)	64-1307
Моноклональное антитело к NPY	Абкам (Кембридж, Массачусетс)	АБ112473
Пользовательский многоканальный усилитель / многоканальный каскад с резистором обратной связи 1 МОм	NPI Electronic, (Тамм, Германия)	NA	На базе многоканального усилителя NPI VA-10M
Допамин гидрохлорид	Сигма Олдрич (Сент-Луис, Миссури)	Н8502-10Г
Позолоченный штырь разъема с наружной резьбой	Подключение AMP-TE (Amplimite)	6-66506-1
HEKA LIH 8+8 аналого-цифровой/цифро-аналоговый прибор	HEKA Elektronik, (Холлистон, Массачусетс)	NA
Программа сбора данных Igor Pro, версия 7.08	WaveMetrics, (озеро Освего, Орегон)		Программное обеспечение, управляющее командным потенциалом и сбором данных, было написано по индивидуальному заказу
Стандартный цифровой перистальтический насос Masterflex L/S	Коул Палмер (Вернон Хиллз, Иллинойс)
Платиновая проволока с покрытием PFA	A-M Systems, (Секим, Вашингтон)	773000	Голый диаметр 0,005 дюйма, диаметр с покрытием 0,008 дюйма
Силиконовый эластомер	World Precision Instruments (Сарасота, Флорида)	SYLG184
Синтетический пептид свиного NPY	Бахем (Торранс, Калифорния)	4011654