1. Подготовка перед маркировкой
- Подготовка и поддержание первичных культур гиппокампа
- Готовят первичные культуры гиппокампа с плотностью 150 000 клеток, покрытых поли-D-лизином (0,1 мг/мл) 18 мм. Существуют отличные руководства по подготовке культуры диссоциированных нейронов.
заметка: При необходимости культуры могут быть обработаны цитозина арабинозидом (Ara-C, 10 мкМ из дней in vitro 1 [DIV1]) для предотвращения глиальной пролиферации в препарате.
заметка: Вместо поли-D-лизина можно использовать альтернативные реагенты для покрытия, такие как фибронектин (1 мг/мл) или ламинин (5 мкг/мл).
- Поддерживайте культуры в клеточном инкубаторе при температуре 37 °C и 5%CO2 в 2 мл/лунке нейробазальных сред с добавлением B27 и 2 мМ L-глутамина><.
заметка: При желании можно использовать заменители L-глютамина (например, Glutamax).
- Еженедельно удаляйте половину объема среды и заменяйте ее таким же объемом добавленной нейробазальной среды.
- ОПЦИОНАЛЬНО: Трансфекция мутировавших и/или меченых эпитопами рецепторов
Примечание: Нейроны должны быть трансфицированы по крайней мере за 3–4 дня до момента проведения анализа, чтобы обеспечить экспрессию рецепторов. Использование молодых нейронов (DIV6–9) приводит к лучшей эффективности трансфекции по сравнению со старыми (DIV15–20) нейронами, но достаточное количество трансфицированных клеток (>20) может быть достигнуто независимо от используемого DIV.
- Для каждой лунки 12-луночного планшета разведите 1,5 г плазмиды, содержащей интересующую конструкцию, в 100 μл свежей нейробазальной среды без добавления B27 или глутамина в микроцентрифужной пробирке и быстро перемешайте путем вортекс><ирования.
заметка: Для успешной трансфекции крайне важно, чтобы используемая нейробазальная среда была как можно более свежей, в идеале менее чем через 1 неделю после вскрытия флакона.
- Во второй микроцентрифужной пробирке смешайте 1 мкл соответствующего реагента для липофекции со 100 мкл свежей нейробазальной среды и аккуратно перемешайте.
заметка: Не делайте вихревыми движениями смесь реагентов для липофектиона. Использование свежих реагентов для липофекции может повысить эффективность трансфекции.
- Инкубируйте пробирки в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
- Добавьте смесь реагентов липофекции по каплям в смесь ДНК, осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 20 минут при RT.
- Отрегулируйте объем среды в каждой лунке до 1 мл кондиционированной среды.
- Добавьте в лунку липофекцию реагента -смесь ДНК по каплям.
- Верните клетки в инкубатор и дайте не менее 3–4 дней для экспрессии белка.
заметка: Для целей протоколов интернализации и рециркуляции, изложенных ниже, нейроны гиппокампа трансфицировали в DIV11–12 с помощью конструкций, экспрессирующих GluN2B, помеченных зеленым флуоресцентным белком (GFP) во внеклеточном домене (GFP-GluN2B) и визуализировали в DIV15–16.
- НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Инкубация клеток с лекарственными препаратами (хронически или остро) в кондиционированных средах до фиксации.
ПРИМЕЧАНИЕ: При остром лечении начните обработку клеток до мечения. В зависимости от используемого протокола лечения препаратом, клетки могут поддерживаться в лекарственных средах во время секции 2. В нашем примере клетки DIV21 подвергались химически индуцированному протоколу долгосрочного потенцирования (cLTP) для увеличения поверхностно-экспрессируемого рецептора α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (AMPAR).
- Замените кондиционированную среду на внеклеточный раствор (ЭКС).
- Обрабатывайте клетки 300 мкМ глицином в ЭКС в течение 3 мин при ЛТ. В качестве контроля обработайте родственный покровный лист ECS (без глицина).
- Промойте клетки 3 раза при 37 °C ECS и верните клетки в ECS (без глицина) в инкубатор для клеток на 20 минут, прежде чем продолжить работу с секцией 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: ECS (в мМ): 150 NaCl, 2 CaCl2, 5 KCl, 10 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновая кислота (HEPES), 30 глюкоза, 0,001 тетродотоксин (TTX), 0,01 стрихнин и 0,03 пикротоксин при pH 7,4.
2. Динамическое мечение поверхностно-экспрессионных рецепторов
- Подготовка покровных листов для маркировки
- Чтобы сэкономить реагенты и облегчить манипуляции, перенесите покровную сторону ячейки вверх на лоток, покрытый парафиновой пленкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно никогда не допускать высыхания образцов.
- Сохраняйте и поддерживайте кондиционированную среду при температуре 37 °C для инкубации и промывки.
заметка: Для покровного стекла толщиной 18 мм рекомендуется инкубация с 75–100 мкл среды для мечения антител и 120–150 мкл для интернализации/переработки.
- Мечение поверхностных рецепторов первичными антителами
- Инкубируют клетки с первичным антителом, разведенным в кондиционированной среде, в течение 15 мин при RT.
заметка: Для рецепторов, меченных GFP, использовали антитела кролика против GFP в разведении 1:1000. Для эндогенного GluA1 использовали мышиный анти-GluA1 в разведении 1:200.
- Осторожно отсасывайте антителосодержащие среды с помощью вакуумной пипетки и трижды промойте клетки кондиционированной средой.
заметка: Если кондиционированная среда недоступна, все этапы промывки можно выполнять с использованием PBS+ [фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 1 мМ MgCl2и 0,1 мМ CaCl2]. Ручная аспирация с помощью микропипетки может быть выполнена, если щадящая вакуумная аспирация недоступна.
3. Поверхностное выражение (Рисунок 1)
- Вторичное мечение антителами рецепторов поверхностной экспрессии
- Постирайте один раз с PBS+.
- Фиксация клеток путем инкубации с 4% параформальдегидом (PFA) и 4% сахарозой в PBS в течение 7–8 мин.
заметка: В отличие от других методов фиксации, таких как инкубация метанолом, PFA не проникает через плазматическую мембрану и поэтому подходит для анализа поверхностной экспрессии. Для достижения оптимальных результатов используйте свежеприготовленный PFA. Кратковременное хранение PFA при температуре 4 °C или длительное (до 30 дней) хранение при -20 °C является допустимым для адекватной фиксации><.
осторожность: PFA является известным канцерогеном. При обращении используйте надлежащие средства индивидуальной защиты и защитный капюшон.
- Вымойте ячейки три раза обычной PBS.
заметка: В качестве альтернативы, 0,1 М глицин может быть использован для промывки PFA вместо PBS, так как глицин погасит любой оставшийся фиксатор, который может увеличить фон в препарате.
- Блокируйте неспецифические сайты связывания путем инкубации с 10% нормальной сывороткой крови коз (NGS) в PBS в течение 30 мин при RT.
заметка: Время блокировки может быть увеличено без негативных последствий для маркировки.
- Инкубировать с флуоресцентно меченным вторичным антителом, разведенным в 3% NGS в PBS, в течение 1 ч в ЛТ для мечения рецепторов, меченных первичными антителами (т.е. экспрессируемых на поверхности).
заметка: В этих примерах использовали разведение 1:500 конъюгированных с Alexa 555 вторичных антител: козий антикролик для рецепторов, меченных GFP, и козий анти-мышиный для GluA1.
- Промойте ячейки PBS 3x.
- Мечение внутриклеточных рецепторов
- Пермеабилизация клеток 0,25% Triton X-100 в PBS в течение 5–10 мин при RT.
заметка: Чтобы проверить, что начальный раунд мечения антител занимает все поверхностные эпитопы, этот этап пермеабилизации может быть пропущен в сестринской культуре. В этом случае не следует получать сигнал для внутриклеточных рецепторов. Кроме того, для проверки того, что в предыдущем разделе 2 не были помечены внутренние рецепторы (т.е. демонстрации целостности плазматических мембран в культуре), стадию пермеабилизации можно пропустить в сестринской культуре, а на стадии 2.2.1 можно использовать первичное антитело против внутриклеточного белка (например, белка постсинаптической плотности 95 [PSD-95] или белка, ассоциированного с микротрубочками 2 [MAP2]). В этих условиях сигнал от этой первичной обмотки получен не должен. В данном случае использовали антитело кролика к PSD-95 (1:500).
- Заблокируйте 10% NGS в PBS на 30 минут при RT.
- Маркировать внутриклеточные рецепторы путем инкубации пермеабилизированных клеток тем же первичным антителом, которое использовалось в разделе 2.2, разведенным в 3% NGS в PBS в течение 1 ч при RT.
заметка: Разведение антител для мечения внутриклеточных рецепторов может отличаться от того, которое требуется для мечения рецепторов с поверхностной экспрессией. В примере с GluA1 использовали тот же разведение антител (1:200).
- Промойте ячейки 3 раза с PBS.
- Мечение вторым флуоресцентно меченным вторичным антителом, разведенным в 3% NGS в PBS в течение 1 ч при RT.
заметка: В этих примерах использовали разведение 1:500 козьего вторичного антитела против мышей Alexa 647 (для GluA1).
- Промойте ячейки 3 раза с PBS.
4. Интернализация (Рисунок 2)
- Интернализация меченых антителами поверхностных рецепторов
- После мечения рецепторов поверхностной экспрессии и промывки антителами (раздел 2.2) поддерживать клетки в кондиционированной среде без антител и возвращать их в инкубатор (37 °C) для интернализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDA) рекомендуется 30 минут для интернализации. В качестве контроля сестринскую культуру можно поддерживать в кондиционированной среде при температуре 4 °C в процессе интернализации. В этих условиях должна происходить минимальная интернализация рецепторов.
- Мечение поверхностных рецепторов
- Промойте ячейки один раз с помощью PBS+.
- Фиксируют клетки с 4% PFA и 4% сахарозой в PBS в течение 7–8 мин.
осторожность: Используйте надлежащие средства индивидуальной защиты и защитный капюшон при работе с PFA.
- Промойте ячейки 3 раза с обычной PBS.
- Заблокируйте 10% NGS в PBS на 30 мин в режиме ЛТ, чтобы предотвратить неспецифическое связывание.
- Инкубируйте образцы с флуоресцентно меченным вторичным антителом, разведенным в 3% NGS в PBS в течение 1 ч при ЛТ, для мечения первичных рецепторов, меченных антителами (т.е. поверхностно-экспрессированных рецепторов, которые не были интернализованы).
заметка: Для этого примера для мечения использовали вторичное антитело против кролика с помощью Alexa 555-конъюгированного козьего антитела (1:500).
- Промойте ячейки 3 раза с PBS.
- Мечение интернализованных рецепторов
- Пермеабилизируйте клетки 0,25% Triton X-100 в PBS в течение 5–10 мин.
- Блокируйте неспецифическое связывание путем инкубации с 10% NGS в PBS в течение 30 мин при ЛТ.
- Инкубируйте образцы с флуоресцентно меченным вторичным антителом, разведенным в 3% NGS в PBS в течение 1 ч в режиме ЛТ, чтобы мечить интернализованные рецепторы, меченные антителами.
заметка: В данном примере для мечения используется вторичное антитело против кролика с Alexa 647-конъюгированным козьим антителом (1:500).
- Промойте ячейки 3 раза с PBS.
5. Переработка (Рисунок 3)
- Интернализация меченых антителами поверхностных рецепторов
- После мечения рецепторов поверхностной экспрессии и промывки антителами (раздел 2.2) поддерживать клетки в кондиционированной среде без антител и возвращать их в инкубатор (37 °C) для интернализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для NMDA-рецепторов рекомендуется 30 минут на интернализацию.
- Блокирование стабильных поверхностных экспрессированных рецепторов
- Для блокирования эпитопов на первичном антителе, прикрепленном к поверхностно-экспрессируемым рецепторам, которые не были интернализованы, инкубируют клетки с неконъюгированными фрагментами антитела Fab anti-IgG (H+L) (против первичного, используемого в разделе 2.2), разведенными в кондиционированной среде (20 мкг/мл) в течение 20 мин в режиме ЛТ. Это лечение предотвращает будущее взаимодействие со вторичными антителами.
заметка: Для этого примера были использованы фрагменты Coat Anti-rabbit Fab.
заметка: Контрольный эксперимент: чтобы убедиться в том, что произошло полное блокирование поверхностно-экспрессионных рецепторов, сестринские покровные стекла можно инкубировать с Fab и без него. Культуры должны быть зафиксированы сразу после обработки Fab, и обе культуры инкубируются с конъюгированными с Alexa 555-конъюгированным вторичным антителом. Отсутствие сигнала Alexa 555 в инкубируемых клетках Fab указывает на надлежащую блокировку антител.
- Промойте ячейки 3 раза кондиционированным средом.
- Инкубируйте клетки с кондиционированной средой, содержащей 80 мкМ диназора, чтобы предотвратить дальнейшую интернализацию и вернуть клетки в инкубатор (37 °C) для обеспечения рециркуляции интернализованных рецепторов. Динасор является ингибитором ГТФазы, который ингибирует динамин и, следовательно, предотвращает интернализацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется 45 минут для переработки NMDAR. Обратите внимание, что Dynasore блокирует исключительно динаминозависимый процесс интернализации (например, интернализацию NMDARs). Тем не менее, интернализация другого синаптического белка (независимого от динамина) все еще может происходить в присутствии Dynasore.
- Маркировка рециркулированных рецепторов
- Промойте ячейки один раз с помощью PBS+.
- Фиксируют клетки с 4% PFA и 4% сахарозой в PBS в течение 7–8 мин.
осторожность: Используйте надлежащие средства индивидуальной защиты и защитный капюшон при работе с PFA.
- Промойте ячейки 3 раза с PBS.
- Заблокируйте 10% NGS в PBS на 30 мин в режиме ЛТ, чтобы предотвратить неспецифическое связывание.
- Меченые клетки с первым флуоресцентно меченным вторичным антителом, разведенным в 3% NGS в PBS в течение 1 ч при RT.
заметка: Для этого примера для мечения использовали 555-конъюгированное антитело козы против кролика (1:500).
- Промывка ячеек 3x с PBS.
заметка: Более длительные стирки с PBS (5–10 минут) могут помочь уменьшить фон при подготовке.
- Мечение интернализованных рецепторов
- Пермеабилизируйте клетки 0,25% Triton X-100 в PBS в течение 5–10 мин.
- Заблокируйте 10% NGS в PBS на 30 минут при RT.
- Мечение вторым флуоресцентно меченным вторичным антителом, разведенным в 3% NGS в PBS в течение 1 ч при RT.
заметка: Для этого примера для мечения использовали конъюгированное с Alexa 647 козье антитело против кролика (1:500).
- Промойте ячейки 3 раза с PBS.
6. Монтаж и визуализация образцов
- Установите ячейки, аккуратно положив покровную ячейку стороной вниз на 12–15 μл соответствующего монтажного материала.
заметка: Использование излишков монтажных носителей улучшит качество изображений.
- Изображение клеток на соответствующем конфокальном микроскопе.
заметка: Рекомендуется визуализировать z-стек с 60-кратным увеличением с шагом 0,35 мкм, охватывающий всю толщину нейрона.
7. Временные соображения
- Это длинный протокол, который может быть остановлен в нескольких точках. При желании проведите этапы блокировки и первичной инкубации антител в течение ночи при 4 °C во влажной камере.
- В качестве альтернативы, при желании, используйте микроволновый тканевый процессор, чтобы значительно ускорить время инкубации после фиксации. Для всех этапов используйте 150 Вт при 30 °C для настроек «Вкл».
- Чтобы заблокировать, запустите процессор на 2 минуты «Вкл.», 1 мин «Выкл.» и 2 мин «Вкл.».
- Для этапов инкубации первичных и вторичных антител запустите процессор в режиме 3 мин «Вкл.», 2 мин «Выкл.» и 3 мин «Вкл.»
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не наблюдаем никакой разницы в качестве при внесении вышеуказанных изменений в протокол.
8. Анализ изображений
- Для проведения анализа изображений рекомендуется использовать FIJI, так как он совместим с несколькими форматами файлов. Для наших данных были получены снимки в формате файла Nikon ND2.
- Макроскрипт предоставляется для простой количественной оценки различных параметров, предварительно выбранных FIJI. В макрос включены следующие шаги:
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих примеров была измерена «интегральная интенсивность».
- Откройте файлы изображений в FIJI и отдельных каналах.
- Z-проекция каждого стека каналов в виде проекции максимальной интенсивности.
- Установите нижний порог для каждого канала.
Примечание: Пороговые значения должны быть определены эмпирически для каждого набора экспериментальных данных. Хотя каждый канал может иметь отдельное нижнее пороговое значение, крайне важно, чтобы пороговые значения канала постоянно поддерживались для всех изображений одного и того же набора данных.
- Выберите от трех до пяти вторичных или третичных дендритов и сохраните их как области интереса (ROI).
- Измерьте интегрированную плотность каждого ROI в поверхностных и внутриклеточных каналах.
- Нормализуйте сигнал для каждого ROI, разделив интегральное значение плотности поверхностного канала на внутриклеточный канал.
- Повторите измерения для всех контрольных и экспериментальных изображений и нормализуйте экспериментальные значения до контрольных значений (например, GluN2B WT или условия без глицина).
