Анализ in vitro для измерения антителозависимого клеточного фагоцитоза фагоцитами

Аннотация

Источник: Пауэлл, Р. Л., и др. Выделение лейкоцитов из грудного молока человека для использования в антителозависимом анализе клеточного фагоцитоза мишеней ВИЧ. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует анализ для измерения антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP) фагоцитами грудного молока. Флуоресцентно меченные микросферы, конъюгированные с комплексом антиген-антитело, комбинируются с клеточной суспензией, выделенной из грудного молока, для индуцирования антителозависимого клеточного фагоцитоза фагоцитарными лейкоцитами. После мечения клеток антителами против общего лейкоцитарного антигена (CD45) с помощью проточной цитометрии измеряют интенсивность флуоресценции микросферически положительных жизнеспособных фагоцитарных лейкоцитов, что указывает на уровень активности ADCP.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Подготовка микросферы-мишени

1. Выберите соответствующий целевой антиген.
   заметка: В этом примере был использован рекомбинантный белок V1V2-2F5K, который был разработан для имитации тримерной вершины нативной оболочки ВИЧ.
2. Проводят биотинилирование с помощью коммерческого набора (Table of Materials) в соответствии с протоколом производителя.
   1. Рассчитайте ммоль реагента биотина для добавления в реакцию для 5-кратного молярного избытка по формуле: ....

Результаты

Рисунок 1: Данные проточной цитометрии клеток, выделенных из грудного молока. Клетки обрабатывались и окрашивались, как описано в протоколе. (A) Одиночные ячейки были забиты для устранения дублетов на графике FSC-H против FSC-A, как показано, а также для удаления мелкого мусора <5000 в FSC-A. (B) Эта популяция была использована для гейта на живых клетках (которые .......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микросферы, меченые NeutrAvidin, 1 мкм	Термо Фишер	Ф8776
BD Pharmingen PE Мышь Анти-Человек CD45	БД	560975
Бычья сыворотка Альбумин	MP Biomedicals	8810025
Пенополистирольная пластина Corning с V-образным дном на 96 лунок	Корнинг	No 3894
Цитохалазин D	сигма	22144-77-0 (Английский
Комплект EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin	Термо Фишер	No 21338
Falcon 15mL Конические центрифужные пробирки	Корнинг	352196
Falcon 50mL Конические центрифужные пробирки	Корнинг	No 352070 (Английский
Фиксируемое пятно для жизнеспособности 450	БД	562247
Раствор формальдегида	сигма	252549
HBSS без кальция, магния и фенола красного	Технологии Life	14175-095
Блок BD Fc человека	БД	564219
Сывороточный альбумин человека	MP Biomedicals	2191349
Kimtech Science Kimwipes Салфетки для деликатных задач	Компания Kimberly-Clark Professional	No 34120 (Английский
PBS 1x pH 7,4	Термо Фишер	10010023
Полистирольные 10 мл серологические пипетки	Корнинг	No 4488
Белковые концентраторы PES, 3K MWCO, 0,5 мл	прокалывать	88512

) ) )