Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка микросферы-мишени
- Выберите соответствующий целевой антиген.
заметка: В этом примере был использован рекомбинантный белок V1V2-2F5K, который был разработан для имитации тримерной вершины нативной оболочки ВИЧ.
- Проводят биотинилирование с помощью коммерческого набора (Table of Materials) в соответствии с протоколом производителя.
- Рассчитайте ммоль реагента биотина для добавления в реакцию для 5-кратного молярного избытка по формуле: ммоль биотин = мл белка х (мг белка/мл белка) х (ммоль биотина/мг белка) х (5 ммоль биотина/ммоль белка). Затем рассчитайте μL биотинового реагента для добавления по формуле: μL biotin = ммоль биотина x (1 000 000 μL/L) x (L/10 ммоль).
- Перед открытием биотин уравновесить до комнатной температуры. Растворите белок в 0,5−2,0 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в соответствии с сделанным выше расчетом.
- Приготовьте 10 мМ раствор биотинового реагента в диметилсульфоксиде (ДМСО) и добавьте соответствующий объем 10 мМ биотинового реагента в белковый раствор, и инкубируйте реакцию на льду в течение 2 ч или при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Удалить избыток биотина с помощью белковых концентраторов (мембраны из полиэфирсульфона [PES], отсечка молекулярной массы 3 кДа [MWCO], 0,5 мл; Таблица материалов) в соответствии с инструкцией производителя.
- Поместите образец в верхнюю камеру спиновой колонки и добавьте PBS до 400 μл. Крышка, затем вставьте эту камеру для образца в пробирку для сбора. Центрифуга при 12 000 x g при комнатной температуре в течение 30 минут.
- Выбросьте проточный раствор и добавьте PBS до 400 μл. Повторите центрифугирование. Откажитесь от проточного потока и добавьте PBS до 100 μл. Измерьте концентрацию белка спектрофотометром.
заметка: Белок можно аликвотировать и замораживать при температуре -80 °C до использования.
2. Подготовка лабораторного планшета для антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP)
- Конъюгируйте биотинилированный белок с микросферами размером 1 мкм («бусины»; Таблица материалов) в соответствии с инструкцией производителя.
- На тарелку конъюгированных шариков инкубируйте 6 г белка с 12 μл бусин в 200 μл 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА)-PBS при комнатной температуре в течение 1 часа, мягко перемешивая каждые 20 минут.
- Центрифугируйте при давлении 13 000 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, осторожно смешайте и повторно суспендируйте в 1200 мкл 0,1% BSA-PBS. Повторите шаг отжима и стирки 2 раза. Ресуспендируйте в 1200 мкл 0,1% BSA-PBS.
- Аликвота 10 мкл раствора в шариках на лунку в круглой нижней 96-луночной пластине. Готовьте разведения антител или представляющих интерес иммунных сывороток в 12 мкл 2% HSA HBSS, обычно начиная с 50 мкг/мл антител или разведения сыворотки 1/100><.
заметка: В данных образца использовали моноклональное антитело (mAb) 830A.
- Добавьте 10 мкл титруемого антитела/сыворотки в тарелку для гранул и инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C. Добавьте 200 мкл 2% HSA HBSS в каждую лунку и центрифугируйте в столовой при 2000 x g в течение 10 мин.
- Осторожно удаляйте надосадочную жидкость путем быстрого переворачивания и сцеживания жидкости из пластинчатых лунок в раковину, чтобы не потревожить невидимую гранулу гранулы.
3. Выделение клеток грудного молока
- Получение грудного молока от здоровых кормящих женщин, сцеженных с помощью двойных электронных или ручных молокоотсосов. Изолируйте клетки в течение ~4 часов после сцеживания, сохраняя молоко при комнатной температуре.
- Используя пробирки объемом 50 мл, центрифугируйте молоко объемом 50 мл при концентрации 800 x г в течение 15 мин. Осторожно слейте обезжиренное молоко и жир, не беспокоя гранулы клеток. Протрите внутреннюю часть трубки безворсовой салфеткой, чтобы удалить весь жир со стенки трубки.
- Добавьте 10 мл 2% белка сыворотки крови человека в сбалансированный раствор соли Хэнка (2% HSA HBSS [безCa2+ или Mg+]). Ресуспендируйте гранулу с помощью щадящего пипетирования, чтобы избежать активации клеток и апоптоза. Переложите в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при давлении 450 x g в течение 10 минут.
- Слейте надосадочную жидкость и повторите шаг 1.3. Затем осторожно ресуспендируют клетки в 1−2 мл 2% HSA HBSS в зависимости от ожидаемого количества клеток и подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток, отмечая также жизнеспособность клеток.
4. Анализ ADCP
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные здесь методы адаптированы из Ackerman et al.
- Добавьте 50 000 свежевыделенных клеток BM в каждую лунку для анализа ADCP в 200 мкл 2% HSA-HBSS. Выдерживать в течение 2 ч при температуре 37 °C.
- Для контрольных экспериментов перед инкубацией клеток при температуре 37 °C с ингибитором актина 10 мкг/мл (цитохалазин-D), блокатором рецепторов Fc в концентрации 50 мкг/мл (FcBlock) или их комбинацией до их добавления в планшеты.
- Центрифугируйте на планшете при 930 x g в течение 10 мин. Добавьте 200 мкл 2% HSA HBSS и повторите центрифугирование. Осторожно удалите надосадочную жидкость, как в шаге 2.7, и повторите стирку.
- Осторожно удалите надосадочную жидкость и покрасьте клетки на жизнеспособность с помощью 0,5 мкг/мл (конечная концентрация) фиксируемого окрашивателя для жизнеспособности 450 на лунку в 50 мкл 2% HSA HBSS. Выдерживать 20 мин при комнатной температуре в темноте. Центрифугируйте планшет при давлении 930 x g в течение 10 минут и удалите надосадочную жидкость, как показано на шаге 2.7. Добавьте 200 мкл 2% HSA HBSS и снова в центрифужную тарелку с последующим удалением надосадочной жидкости, как на шаге 2.7.
- После окрашивания на жизнеспособность клетки окрашивают на лейкоцитарные маркеры, представляющие интерес, минимально включая CD45-специфичный краситель, такой как PE-mouse anti-human CD45 (клон HI30) в оптимизированной концентрации (1 мкг/мкл в 50 мкл 1% BSA HBSS в данных примера).
заметка: Могут быть включены любые маркеры, специфичные для линии.
- Выдерживать 20 мин при комнатной температуре в темноте. Центрифугируйте планшет при давлении 930 x g в течение 10 минут и удалите надосадочную жидкость, как показано на шаге 2.7. Добавьте 200 мкл 1% BSA HBSS и повторите центрифугирование. Удалите надосадочную жидкость. Зафиксируйте клетки в 200 мкл 0,5% формальдегида в темноте при комнатной температуре на 30 мин или на ночь при 4 °C. Охладите в темноте до анализа.
5. Анализ с помощью проточной цитометрии
- Выполните начальное стробирование, чтобы устранить дублеты на графике прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) и мусора (материал меньше FSC = 5000) (см. рис. 1). Используйте график зависимости SSC от окрашивания жизнеспособности (в данном случае V450) для удаления мертвых клеток (тех, которые положительно влияют на окрашивание жизнеспособности).
- Используйте график сравнения SSC и CD45 для дифференциации основных классов лейкоцитов (гранулоцитов, моноцитов, лимфоцитов), как подробно описано.
заметка: Эта классификация является лишь предположительной, и для подтверждения типа клеток необходимы маркеры, специфичные для линии.
- Для всех CD45+ клеток или для каждого интересующего подмножества лейкоцитов измерьте активность ADCP путем гейтирования маркером на гранул-положительных клетках на гистограмме канала флуоресцеина изотиоцианата (FITC), где обнаруживаются флуоресцентные шарики.
заметка: Отрицательные контрольные лунки, в которые не были добавлены шарики, укажут, где на гистограмме видны положительные клетки бисера и, следовательно, где следует разместить маркер стробирования.
- Рассчитайте баллы ADCP как (медиана интенсивности флуоресценции [MFI] гранул-положительных клеток) x (% от общего количества CD45+ клеток в положительной популяции). Используйте графическое программное обеспечение для построения графиков оценки при каждой концентрации Ab/сыворотки и для выполнения анализа площади под кривой (AUC).
заметка: ADCP считается положительным, если AUC превышает 3-кратное стандартное отклонение от оценки ADCP AUC неспецифического отрицательного контрольного mAb (в данном случае 3865).
