Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Получение иммунных клеток из селезенки мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Усыпляйте наивных мышей с помощью эвтаназии углекислым газом (CO2). Мыши C57BL/6, приобретенные в Jackson Laboratories и выращенные на заводе, используются для экспериментов в возрасте 6-12 недель. Для экспериментов используются как самцы, так и самки мышей.
- Продезинфицируйте кожу мыши 70% этанолом, чтобы снизить возможность попадания внешних загрязнений в образец.
- Рассеките селезенку мыши с помощью инструментов для препарирования, хирургических ножниц и щипцов. Соберите селезенку и поместите отделенную селезенку в коническую трубку объемом 50 мл с ~5 мл полной среды Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) на льду.
заметка: Полный RPMI состоит из 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина.
- Чтобы собрать мышиную селезенку, сделайте ножницами 5-сантиметровый надрез на шерсти и коже вдоль левой стороны мыши на полпути между передними и задними лапами. Откройте полость тела на ~5 см и удалите селезенку с помощью щипцов. Селезенка имеет цвет фасоли, она длиннее и плоская, чем соседняя почка.
- Вылейте содержимое шага 1.2 на стерильный фильтр 70 мкм, прикрепленный к новой конической пробирке объемом 50 мл. Механически разделите селезенку на одноклеточную суспензию, протолкнув селезенку через фильтр с помощью поршня шприца объемом 5 мл до тех пор, пока на поверхности фильтра не останется пульпы селезенки.
- Гранулируйте спленоциты с помощью настольной центрифуги с поворотным ротором при давлении 500 x g в течение 5 минут при 4 °C.
- Аккуратно сцедите надосадочную жидкость. Гранулированные спленоциты остаются на дне конической пробирки объемом 50 мл.
- Для удаления эритроцитов повторно суспендируйте гранулированные спленоциты в 1 мл буфера для лизиса аммония-хлорида-калия (ACK) на 3 мин в соответствии с инструкциями производителя. Хорошо перемешайте.
- Охладите буфер для лизиса ACK 15 мл cRPMI.
- Гранулируйте лимфоциты в соответствии с инструкциями на шаге 1.4.
- Повторно суспендируйте клеточную суспензию в 5 мл cRPMI в конической трубке объемом 50 мл. Поместите образцы на лед.
- Чтобы подсчитать клетки, перенесите 10 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку объемом 0,6 мл и разведите в соотношении 1:1 раствором трипанового синего. Затем переведите на гемоцитометр или автоматизированную систему подсчета клеток.
- После подсчета, в зависимости от концентрации клеток в клеточной суспензии, как на шаге 1.9, гранулируют клетки в настольной центрифуге при 500 x g при 4 °C в течение 5 мин для приготовления к добавлению среды cRMPI, содержащей эфирный краситель Indo-1 AM.
- Рассчитайте объем для повторного суспендирования клеток для достижения 10-12 x 106 клеток/мл. Это концентрация в 2 раза от общего необходимого количества клеток.
- Повторно суспендируйте ячейки в объеме cRPMI, рассчитанном на шаге 1.11. Поместите клетки при температуре 37 °C с 5%CO2 либо в коническую пробирку объемом 50 мл с вентилируемой крышкой, либо в планшет для культуры тканей.
2. Индионометрический краситель Indo-1 и мечение флуоресцентными антителами
- В соответствии с инструкциями производителя добавьте 50 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) во флакон, содержащий 50 мкг Indo-1 AM. Концентрация исходного раствора составляет 1 мкг/л<бр/>
заметка: ДМСО поставляется в микрофлаконах с набором для предотвращения любого окисления ДМСО.
- Разбавьте исходную аликвоту (1 мкг/мкл) до соответствующего экспериментального объема (установленного в 1.11) cRPMI в концентрации 6 мкг/мл, что в 2 раза больше. Не храните Indo-1 в водном растворе.
заметка: Другие буферы с добавлением кальция могут быть использованы в зависимости от потребностей клеток.
- Отставьте весь фильтрующий материал с Indo-1 в сторону на водяной бане при температуре 37 °C.
заметка: Используйте минимальную концентрацию эфира Индо-1 АМ, необходимую для получения адекватного сигнала. Его необходимо титровать для различных типов клеток. Как правило, достаточно концентрации в пределах 3-5 μМ. Для первичных Т-клеток загрузка клеток индо-1 в концентрации >5 г/мл увеличивает среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) выше log 6 на спектральных проточных цитометрах. В этом случае уменьшите интенсивность ультрафиолетового (УФ) лазера и титруйте Indo-1 до более низкой концентрации.
- Разведите предварительно приготовленную клеточную суспензию (на шаге 1.12) в соотношении 1:1 в cRPMI, включая 2x Indo-1 среды, полученные на шаге 2.2. Убедитесь, что концентрация клеток находится в диапазоне 5-6 x 106/мл.
заметка: Не загружайте неокрашенный контроль одинарного пятна или поверхностный маркер с одним пятном с помощью Indo-1. Добавление Indo-1 к контрольным антителам к одному окрашиванию позволит создать многоцветный образец благодаря добавлению Indo-1 к одиночным окрашенным клеткам. Включите индо-1 (не содержащую кальция) этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA), добавленную в контрольную часть образца, созданную на шаге 2.6.
- Добавьте 1 мл клеток/лунок/экспериментальных условий в 12-луночный планшет для культивирования тканей.
- Создайте один окрашенный контроль для образца Indo-1 (без кальция) с использованием ранее загруженных Indo-1 красителей и добавьте EGTA до конечной концентрации 2 мМ. EGTA будет хелатировать кальций в клеточной суспензии, давая более чистый контрольный образец.
- Создать положительный контроль Indo-1 (Indo-1 связанный с кальцием) путем добавления 50 мкМ иономицина в суспензию клеток, загруженных красителем, на проточном цитометре. Иономицин представляет собой мембранопроницаемый ионофор кальция, который связывает ионы кальция и облегчает перенос ионов кальция в клетки.
- Создать лунку для биологически негативного контроля без флуорофоров и красителя Indo-1.
- Создайте лунку для контроля одиночного окрашивания для любых дополнительных популяций клеток, представляющих интерес (антитела, определяемые пользователем) с использованием флуорофоров, конъюгированных антителами, в конструкции панели проточной цитометрии. Они не будут включать ратиометрический краситель Indo-1.
- Добавьте антитело, блокирующее Fc-рецепторы (~2 мкг/1 x 106 клеток), в соответствии с инструкциями производителя, перед добавлением дополнительных конъюгированных с флуорохромом антител для окрашивания поверхности.
- Инкубируйте планшет в течение 45 минут при температуре 37 °C с 5%CO2.
- Ресуспендируйте клетки в 12-луночной пластине, осторожно постукивая по пластине каждые 15 минут.
- Перемешайте и удалите весь объем взвешенных в среде ячеек с 12-луночного планшета. Затем добавьте клеточную суспензию в микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл.
- Гранулируйте клетки в микроцентрифуге при давлении 500 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Сцедите надосадочную жидкость и промойте ячейки, добавив 1 мл предварительно подогретого cRPMI. Снова слейте леденцовку и сцедите надосадочную жидкость. <бр/>
заметка: Промывание клеток удаляет все оставшиеся антитела, блокирующие Fc.
- Ресуспендируйте клетки в 1 мл cRPMI в микроцентрифужных пробирках объемом 1,7 мл и инкубируйте каждую пробирку при 37 °C в течение дополнительных 30 минут при 5%CO2, оставляя верхнюю часть пробирки слегка открытой для обеспечения газообмена. Это позволяет полностью деэтерифицировать внутриклеточные эфиры АМ.
- При необходимости перенесите клетки обратно в 12-луночный планшет для культуры тканей. Дополнительные титруемые антитела, конъюгированные с флуорохромом, могут быть добавлены в фазе покоя.
заметка: Маркеры, используемые на панели методов, включают: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 и тетрамер CD1d/α-гальцера. Маркеры выбираются для анализа подмножеств Т-клеток.
- Создайте мастер-смесь всех пользовательских конъюгированных антител с фторохромом в соответствии с типами интересующих клеток в предварительно титруемом объеме в микроцентрифужной пробирке объемом 1,7 мл.
- Добавьте рассчитанную мастер-смесь на 1 мл объема клетки, в зависимости от титруемых антител к покоящимся клеткам.
заметка: Преимущество окрашивания на этапе 2.15 по сравнению с более поздним этапом 2.18 заключается в том, что окрашивание на шаге 2.15 уменьшит общее время инкубации для эксперимента. Однако окрашивание в общем объеме 1 мл на шаге 2,15 увеличивает использование антител.
- После отдыха гранулируйте клетки при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.<бр/>
заметка: Клетки в 12-луночном планшете для культивирования тканей могут быть гранулированы в планшете с помощью планшетного центрифуги. В противном случае гранулируйте клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
- Промойте ячейки, повторно суспендируя гранулу в 1 мл при температуре 4 °C в холодном cRPMI, и снова гранулируйте ячейки, как показано в шаге 2.16. Поместите клетки на лед.
заметка: Если поверхностное окрашивание клеток отдельно, то после деэтерификации на этапе 2.18 требуется меньший объем антител. Поверхностное окрашивание на этом этапе может быть выполнено после фазы покоя в буфере холодного потока (1x фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) с добавлением 1% FBS) с использованием определенных пользователем антител на льду в течение 30 минут. Простирайте клетки после пятна в cRPMI, как описано в шаге 2.17.
- Добавьте в образцы морилку для жизнеспособности Ghost540, разведенную в соотношении 1:7,500 в DPBS, согласно инструкции производителя. Тепло убивает клетки при 55 °C на нагревательном блоке для контроля одиночных пятен живых/мертвых.
заметка: Окрашивание функционального красителя на жизнеспособность для удаления мертвых клеток при проточном цитометрическом анализе проводится без FBS. FBS может взаимодействовать с аминными красителями в соответствии с инструкциями производителя.
- Повторно суспендируйте отдельные образцы в 500 мкл cRPMI (фенол без красного) с помощью проточной трубки из полистирола объемом 5 мл с крышкой.
заметка: Клетки можно оставлять при температуре 4 °C на срок до часа.
- Нагрейте каждую пробирку объемом 5 мл с клетками по отдельности до 37 °C с помощью ванны с шариками в течение 7 минут перед анализом на проточном цитометре, сохраняя одинаковое время между образцами. Используйте таймер.
3. Трубка для ванны с шариками: поддержание температуры во время анализа кальциевого потока
- Добавьте шарики для ванны на небольшую водяную баню без добавления воды; нагрейте до 37 °C.
- Осторожно разрежьте коническую трубку объемом 50 мл пополам, на отметке 25 мл, лезвием бритвы; выбросьте верхнюю часть трубки.
- Заполните разрезанную пополам трубку на 3/4 бусинами для ванны.
- Поместите трубку, созданную на шаге 3.2, в ванночку, созданную на шаге 3.1. Доведите пробирку и бусины до 37 °C.
- Подключите ванночку с шариками к электрической розетке рядом с проточным цитометром, чтобы поддерживать температуру при подготовке к анализу образца.
- Добавьте конический штатив объемом 50 мл из пенополистирола для удержания одной пробирки, чтобы расположить пробирку на месте во время работы на проточном цитометре. Это избавит от необходимости вручную удерживать трубку в течение всего времени анализа кривой.
