Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка индуцированного Т-клеточными рецепторами притока кальция с помощью красителя-индикатора кальция

991 просмотров

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

Источник: Perrenoud, L. et al., Анализ индуцированного рецепторами Т-клеток притока кальция в первичных Т-клетках мыши с помощью проточной цитометрии полного спектра.J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео анализируется индуцированный рецепторами Т-клеток приток кальция в Т-клетки. Антитела к CD3 активируют сигнальные пути Т-клеток, что приводит к увеличению внутриклеточных ионов кальция, которые связываются с красителем Indo-1. В проточной цитометрии сдвиг спектра от свободного от кальция состояния к кальций-связанному коррелирует с индуцированным Т-клеточными рецепторами притоком кальция.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Получение иммунных клеток из селезенки мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Усыпляйте наивных мышей с помощью эвтаназии углекислым газом (CO2). Мыши C57BL/6, приобретенные в Jackson Laboratories и выращенные на заводе, используются для экспериментов в возрасте 6-12 недель. Для экспериментов используются как самцы, так и самки мышей.

  1. Продезинфицируйте кожу мыши 70% этанолом, чтобы снизить возможность попадания внешних загрязнений в образец.
  2. Рассеките селезенку мыши с помощью инструментов для препарирования, хирургических ножниц и щипцов. Соберите селезенку и поместите отделенную селезенку в коническую трубку объемом 50 мл с ~5 мл полной среды Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) на льду.
    заметка: Полный RPMI состоит из 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина.
    1. Чтобы собрать мышиную селезенку, сделайте ножницами 5-сантиметровый надрез на шерсти и коже вдоль левой стороны мыши на полпути между передними и задними лапами. Откройте полость тела на ~5 см и удалите селезенку с помощью щипцов. Селезенка имеет цвет фасоли, она длиннее и плоская, чем соседняя почка.
  3. Вылейте содержимое шага 1.2 на стерильный фильтр 70 мкм, прикрепленный к новой конической пробирке объемом 50 мл. Механически разделите селезенку на одноклеточную суспензию, протолкнув селезенку через фильтр с помощью поршня шприца объемом 5 мл до тех пор, пока на поверхности фильтра не останется пульпы селезенки.
  4. Гранулируйте спленоциты с помощью настольной центрифуги с поворотным ротором при давлении 500 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  5. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость. Гранулированные спленоциты остаются на дне конической пробирки объемом 50 мл.
  6. Для удаления эритроцитов повторно суспендируйте гранулированные спленоциты в 1 мл буфера для лизиса аммония-хлорида-калия (ACK) на 3 мин в соответствии с инструкциями производителя. Хорошо перемешайте.
  7. Охладите буфер для лизиса ACK 15 мл cRPMI.
  8. Гранулируйте лимфоциты в соответствии с инструкциями на шаге 1.4.
  9. Повторно суспендируйте клеточную суспензию в 5 мл cRPMI в конической трубке объемом 50 мл. Поместите образцы на лед.
    1. Чтобы подсчитать клетки, перенесите 10 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку объемом 0,6 мл и разведите в соотношении 1:1 раствором трипанового синего. Затем переведите на гемоцитометр или автоматизированную систему подсчета клеток.
  10. После подсчета, в зависимости от концентрации клеток в клеточной суспензии, как на шаге 1.9, гранулируют клетки в настольной центрифуге при 500 x g при 4 °C в течение 5 мин для приготовления к добавлению среды cRMPI, содержащей эфирный краситель Indo-1 AM.
  11. Рассчитайте объем для повторного суспендирования клеток для достижения 10-12 x 106 клеток/мл. Это концентрация в 2 раза от общего необходимого количества клеток.
  12. Повторно суспендируйте ячейки в объеме cRPMI, рассчитанном на шаге 1.11. Поместите клетки при температуре 37 °C с 5%CO2 либо в коническую пробирку объемом 50 мл с вентилируемой крышкой, либо в планшет для культуры тканей.

2. Индионометрический краситель Indo-1 и мечение флуоресцентными антителами

  1. В соответствии с инструкциями производителя добавьте 50 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) во флакон, содержащий 50 мкг Indo-1 AM. Концентрация исходного раствора составляет 1 мкг/л<бр/> заметка: ДМСО поставляется в микрофлаконах с набором для предотвращения любого окисления ДМСО.
  2. Разбавьте исходную аликвоту (1 мкг/мкл) до соответствующего экспериментального объема (установленного в 1.11) cRPMI в концентрации 6 мкг/мл, что в 2 раза больше. Не храните Indo-1 в водном растворе.
    заметка: Другие буферы с добавлением кальция могут быть использованы в зависимости от потребностей клеток.
  3. Отставьте весь фильтрующий материал с Indo-1 в сторону на водяной бане при температуре 37 °C.
    заметка: Используйте минимальную концентрацию эфира Индо-1 АМ, необходимую для получения адекватного сигнала. Его необходимо титровать для различных типов клеток. Как правило, достаточно концентрации в пределах 3-5 μМ. Для первичных Т-клеток загрузка клеток индо-1 в концентрации >5 г/мл увеличивает среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) выше log 6 на спектральных проточных цитометрах. В этом случае уменьшите интенсивность ультрафиолетового (УФ) лазера и титруйте Indo-1 до более низкой концентрации.
  4. Разведите предварительно приготовленную клеточную суспензию (на шаге 1.12) в соотношении 1:1 в cRPMI, включая 2x Indo-1 среды, полученные на шаге 2.2. Убедитесь, что концентрация клеток находится в диапазоне 5-6 x 106/мл.
    заметка: Не загружайте неокрашенный контроль одинарного пятна или поверхностный маркер с одним пятном с помощью Indo-1. Добавление Indo-1 к контрольным антителам к одному окрашиванию позволит создать многоцветный образец благодаря добавлению Indo-1 к одиночным окрашенным клеткам. Включите индо-1 (не содержащую кальция) этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA), добавленную в контрольную часть образца, созданную на шаге 2.6.
  5. Добавьте 1 мл клеток/лунок/экспериментальных условий в 12-луночный планшет для культивирования тканей.
  6. Создайте один окрашенный контроль для образца Indo-1 (без кальция) с использованием ранее загруженных Indo-1 красителей и добавьте EGTA до конечной концентрации 2 мМ. EGTA будет хелатировать кальций в клеточной суспензии, давая более чистый контрольный образец.
    1. Создать положительный контроль Indo-1 (Indo-1 связанный с кальцием) путем добавления 50 мкМ иономицина в суспензию клеток, загруженных красителем, на проточном цитометре. Иономицин представляет собой мембранопроницаемый ионофор кальция, который связывает ионы кальция и облегчает перенос ионов кальция в клетки.
  7. Создать лунку для биологически негативного контроля без флуорофоров и красителя Indo-1.
  8. Создайте лунку для контроля одиночного окрашивания для любых дополнительных популяций клеток, представляющих интерес (антитела, определяемые пользователем) с использованием флуорофоров, конъюгированных антителами, в конструкции панели проточной цитометрии. Они не будут включать ратиометрический краситель Indo-1.
  9. Добавьте антитело, блокирующее Fc-рецепторы (~2 мкг/1 x 106 клеток), в соответствии с инструкциями производителя, перед добавлением дополнительных конъюгированных с флуорохромом антител для окрашивания поверхности.
  10. Инкубируйте планшет в течение 45 минут при температуре 37 °C с 5%CO2.
  11. Ресуспендируйте клетки в 12-луночной пластине, осторожно постукивая по пластине каждые 15 минут.
  12. Перемешайте и удалите весь объем взвешенных в среде ячеек с 12-луночного планшета. Затем добавьте клеточную суспензию в микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл.
  13. Гранулируйте клетки в микроцентрифуге при давлении 500 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Сцедите надосадочную жидкость и промойте ячейки, добавив 1 мл предварительно подогретого cRPMI. Снова слейте леденцовку и сцедите надосадочную жидкость. <бр/> заметка: Промывание клеток удаляет все оставшиеся антитела, блокирующие Fc.
  14. Ресуспендируйте клетки в 1 мл cRPMI в микроцентрифужных пробирках объемом 1,7 мл и инкубируйте каждую пробирку при 37 °C в течение дополнительных 30 минут при 5%CO2, оставляя верхнюю часть пробирки слегка открытой для обеспечения газообмена. Это позволяет полностью деэтерифицировать внутриклеточные эфиры АМ.
  15. При необходимости перенесите клетки обратно в 12-луночный планшет для культуры тканей. Дополнительные титруемые антитела, конъюгированные с флуорохромом, могут быть добавлены в фазе покоя.
    заметка: Маркеры, используемые на панели методов, включают: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 и тетрамер CD1d/α-гальцера. Маркеры выбираются для анализа подмножеств Т-клеток.
    1. Создайте мастер-смесь всех пользовательских конъюгированных антител с фторохромом в соответствии с типами интересующих клеток в предварительно титруемом объеме в микроцентрифужной пробирке объемом 1,7 мл.
    2. Добавьте рассчитанную мастер-смесь на 1 мл объема клетки, в зависимости от титруемых антител к покоящимся клеткам.
      заметка: Преимущество окрашивания на этапе 2.15 по сравнению с более поздним этапом 2.18 заключается в том, что окрашивание на шаге 2.15 уменьшит общее время инкубации для эксперимента. Однако окрашивание в общем объеме 1 мл на шаге 2,15 увеличивает использование антител.
  16. После отдыха гранулируйте клетки при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.<бр/> заметка: Клетки в 12-луночном планшете для культивирования тканей могут быть гранулированы в планшете с помощью планшетного центрифуги. В противном случае гранулируйте клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл.
  17. Промойте ячейки, повторно суспендируя гранулу в 1 мл при температуре 4 °C в холодном cRPMI, и снова гранулируйте ячейки, как показано в шаге 2.16. Поместите клетки на лед.
    заметка: Если поверхностное окрашивание клеток отдельно, то после деэтерификации на этапе 2.18 требуется меньший объем антител. Поверхностное окрашивание на этом этапе может быть выполнено после фазы покоя в буфере холодного потока (1x фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) с добавлением 1% FBS) с использованием определенных пользователем антител на льду в течение 30 минут. Простирайте клетки после пятна в cRPMI, как описано в шаге 2.17.
    1. Добавьте в образцы морилку для жизнеспособности Ghost540, разведенную в соотношении 1:7,500 в DPBS, согласно инструкции производителя. Тепло убивает клетки при 55 °C на нагревательном блоке для контроля одиночных пятен живых/мертвых.
      заметка: Окрашивание функционального красителя на жизнеспособность для удаления мертвых клеток при проточном цитометрическом анализе проводится без FBS. FBS может взаимодействовать с аминными красителями в соответствии с инструкциями производителя.
  18. Повторно суспендируйте отдельные образцы в 500 мкл cRPMI (фенол без красного) с помощью проточной трубки из полистирола объемом 5 мл с крышкой.
    заметка: Клетки можно оставлять при температуре 4 °C на срок до часа.
  19. Нагрейте каждую пробирку объемом 5 мл с клетками по отдельности до 37 °C с помощью ванны с шариками в течение 7 минут перед анализом на проточном цитометре, сохраняя одинаковое время между образцами. Используйте таймер.

3. Трубка для ванны с шариками: поддержание температуры во время анализа кальциевого потока

  1. Добавьте шарики для ванны на небольшую водяную баню без добавления воды; нагрейте до 37 °C.
  2. Осторожно разрежьте коническую трубку объемом 50 мл пополам, на отметке 25 мл, лезвием бритвы; выбросьте верхнюю часть трубки.
  3. Заполните разрезанную пополам трубку на 3/4 бусинами для ванны.
  4. Поместите трубку, созданную на шаге 3.2, в ванночку, созданную на шаге 3.1. Доведите пробирку и бусины до 37 °C.
  5. Подключите ванночку с шариками к электрической розетке рядом с проточным цитометром, чтобы поддерживать температуру при подготовке к анализу образца.
  6. Добавьте конический штатив объемом 50 мл из пенополистирола для удержания одной пробирки, чтобы расположить пробирку на месте во время работы на проточном цитометре. Это избавит от необходимости вручную удерживать трубку в течение всего времени анализа кривой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12-луночные пластины, обработанные ТСКлеточное лечение229111
50 мл коническийГрайнер Био141-12-17-03Полипропиленовые центрифужные пробирки 50 мл с крышкой
Проточные трубки из полистерола 5 млКорнинг352052
Шприц объемом 5 млШприц BD309646Используется только плунжер, но его выбрасывают
Фильтр 70 мкМГрайнер биография1542070 (Английский
аCD3 (17А2)Биолегенда100202
Буфер для лизиса AKCGibcoA1049201
Спектральный проточноцитометр Aurorahttps://cytekbio.com/pages/aurora
Бусы для ванныКолепармерТовар # UX-06274-52
CD19 ПЭТонбо50-0193-У100
CD1d Tetramer APCНИЗ
КД25 ПЭКи7ebioscience15-0251 (Английский
CD4 APC Cy7Тонбо25-0042-У100
CD8a FITCebioscienceТел.: 11-0081-85
Клеточный инкубаторФормально-научная
Инструменты для рассечения щипцамиМаккессон#487593Тканевые щипцы McKesson Adson 4-3/4 дюйма длиной офис нержавеющая сталь нестерильная неблокирующая ручка для большого пальца 1 x 2 зуба
Инструменты для препарирования НожницыМаккессон#970135Операционные ножницы McKesson Argent™ 4-1/2 дюйма хирургического класса нержавеющая сталь для пальца кольцо ручка прямой острый кончик / острый кончик
DPBS 1xGibco14190-136ДПБС
ЭГТАрыбакNC1280093
ФБСГикрондSH30071.03лот AE29165301
Программное обеспечение FlowJohttps://www.flowjo.com/
Indo1-AM Эфирный красительebioscienceТел.: 65-085-39Кальциевый загружающий краситель
ИономицинМногородность407951-1мг
Живой/Мертвый призрак 540Тонбо13-0879-Т100
Микроцентрифужные пробирки 1,7 млСветовые лабораторииА-7001
Пенициллин/стрептомицин/L-глютаминGibco10378-016
ПРН694Мед Хим ЭкспрессХай-12688
Очищенный антимышиный CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)Тонбо70-0161-М001Блок ФК
РПМИGibco1875093 + фенол красный
RPMI без фенолаGibco11835030 -фенол красный
Настольная центрифугаБекман КоултерАллегра612
TCRβ PerCP Cy5.5ebioscience45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5ebioscienceТел.: 15-5961-82
Набор реагентов Vi-Cell BluКод товара: C06019Включает Трипан
Vi-Cell BluБекман Коултер
Водяная баняСухая ванна марки Fisher
) ) гг.

Теги

Indo 1CD3FcIndo 1Indo 1