Анализ для количественной оценки связывания VLP норовируса человека с кишечными бактериями

Аннотация

Источник: Madrigal, J. L., et al. Количественная оценка связывания вирусоподобных частиц норовируса человека с комменсальными бактериями с помощью проточной цитометрии. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует анализ для количественного определения вирусоподобных частиц (VLP) норовируса человека, связывающихся с кишечными бактериями человека. Бактериальные суспензии смешивают с VLP и инкубируют для образования комплексов VLP-бактерий. Затем комплексы мечаются мечеными флуорофорами VLP-специфическими антителами, после чего проводится визуализация и количественное определение на основе проточной цитометрии для определения процента бактерий, связанных с VLP.

Протокол

1. Анализ прикрепления VLP-бактерий

ВНИМАНИЕ: VLP норовируса человека представляют опасность уровня биобезопасности (BSL)-2, и все работы, связанные с VLP, должны выполняться в шкафу биобезопасности. Подготовка бактериальных культур перед анализом присоединения должна проводиться с использованием безопасных условий, соответствующих организму.

1. Подготовка реагентов
   1. 1x фосфатно-солевой буфер (PBS)
      1. Приготовьте 1 л 10x PBS, растворив пакетик в 1 л деионизированной (DI) воды.
      2. Раствор автоклава в течение 30 мин.
      3. Приготовьте 1x раствор, разбавив вышеуказанный раствор 1:10 в деионизированной воде.
      4. Фильтр стерилизует раствор, пропуская его через фильтр 0,22 мкм и храня при комнатной температуре.
   2. 5% BSA
      1. Добавьте 5 г порошка бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 100 мл PBS для получения 5% раствора.
      2. Перемешайте раствор с помощью вортекса или с помощью металлической мешалки на мешалке до тех пор, пока комки не растворятся.
      3. Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм.
      4. Хранить раствор при температуре 4 °C.
   3. Проточная цитометрия с окрашиванием буфера (FCSB)
      1. Фильтр приобретенного FCSB (см. Таблицу материалов) проходит через фильтр 0,22 мкм.
      2. Храните оставшийся раствор при температуре 4 °C.
   4. 5% буфер блокировки (BB)
      заметка: Готовьте каждый раз свежий.
      1. Добавьте 0,5 г БСА к 10 мл стерильного FCSB.
      2. Вортексом тщательно перемешать образец и оставить на льду до использования.
2. Конъюгация антител
   1. Конъюгируйте антитела к норовирусу человека GII (см. Таблицу материалов) с r-фикоэритрином (ПЭ) с использованием набора для мечения антител R-ПЭ в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
   2. Храните конъюгированное антитело в темноте при температуре 4 °C для дальнейшего использования в анализе прикрепления VLP-бактерий.
      заметка: Первичное антитело следует титровать перед использованием в анализе присоединения VLP-бактерий для определения надлежащей концентрации, необходимой для анализа проточной цитометрии. Титрование антител следует проводить каждый раз при проведении реакции конъюгации и для каждой бактерии, используемой в анализе присоединения.
3. Титрование антител
   1. Конъюгированное антитело к норовирусу человека GII разбавляют в 100 раз, с начальным разведением 1:100 и конечным разведением 1:600 (всего шесть разведений).
   2. Проведите анализ присоединения вирусов, как описано ниже, за следующим исключением: на шаге 1.5.7 повторно суспендируйте бактериальную гранулу в 350 мкл 5% BB.
   3. Разделите образец на семь аликвот по 50 мкл.
   4. Добавьте по 50 мкл каждого разведения антитела в одну пробирку.
   5. Добавьте 50 мкл 5% BB в седьмую пробирку в качестве неокрашенного контроля.
   6. Проведите проточную цитометрию на всех образцах, как описано ниже.
   7. Сравните разведенные образцы антител с неокрашенным контролем и друг с другом. Для последующих анализов следует выбирать самую низкую концентрацию антител, которая не приводит к снижению или потере положительного сигнала.
4. Подготовка бактерий
   1. Выращивайте бактерии в 40 мл соответствующей жидкой среды при соответствующих атмосферных условиях до тех пор, пока бактерии не перейдут в неподвижную фазу.
      1. Выращивайте культуры Enterobacter cloacae аэробно в течение ночи в бульоне Luria при температуре 37 °C, встряхивая со скоростью 200 об/мин до достижения неподвижной фазы.
      2. Выращивайте культуры Lactobacillus gasseri в бульоне Де Мана, Рогосы и Шарпа (MRS) в черных пробирках с завинчивающейся крышкой без встряхивания на водяной бане, установленной при температуре 37 °C, в течение 18 часов до достижения неподвижной фазы.
   2. Перенесите культуры в неподвижной фазе в чистые конические пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте образцы при давлении 2 288 x g в течение 10 минут, чтобы гранулировать бактерии.
   3. Извлеките надосадочную жидкость и повторно суспендируйте ее в 13 мл стерильного 1x PBS. Повторите этот шаг промывки в общей сложности два раза.
   4. Снова центрифугируйте образцы, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте образцы в 20 мл 1x PBS.
      заметка: Если гранула клетки мала, объем ресуспензии может быть уменьшен.
   5. Измерьте наружный диаметр₆₀₀ культуры.
   6. С помощью стандартной кривой определяют колониеобразующую единицу (КОЕ) на мл промытой культуры.
   7. Разбавьте бактерии 1x PBS, чтобы довести концентрацию культуры до 1 x 10⁸ КОЕ/мл.
   8. Перенесите 1 мл бактериальной культуры 1 x 10⁸ КОЕ/мл в необходимые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
   9. Центрифугируйте пробирки при давлении 10 000 x g в течение 5 минут.
   10. Ресуспендируйте бактериальную гранулу в 1 мл стерильного 5% BSA.
   11. Инкубируйте пробирки в течение 1 ч при температуре 37 °C при постоянном вращении.
5. Прикрепление вируса
   1. Работая в шкафу биобезопасности BSL-2, добавьте 10 г VLP норовируса человека (HuNoV) (см. Таблицу материалов) в каждую пробирку, содержащую бактерии, ресуспендированные в PBS, и тщательно перемешайте с помощью пипетирования.
      заметка: Концентрация VLP отличается с каждым препаратом VLP. Таким образом, объем, добавляемый к бактериям, будет варьироваться в зависимости от партии препарата и должен быть соответствующим образом скорректирован таким образом, чтобы в каждую пробирку в эксперименте добавлялось 10 мкг. Для контрольных образцов, содержащих только бактерии (например, образцы без VLP), добавьте объем PBS, равный объему VLP, добавленному в экспериментальные образцы.
   2. Инкубируйте пробирки в течение 1 ч при температуре 37 °C при постоянном вращении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трубчатый револьвер (см. Таблицу материалов), установленный на 40 оборотов в минуту, используется во время инкубации.
   3. После инкубации образцы центрифугируют при давлении 10 000 x g в течение 5 минут.
   4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте бактериальную гранулу в 1 мл PBS.
   5. Повторите шаги стирки 1.5.3 и 1.5.4.
   6. Центрифугируйте образцы при давлении 10 000 x g в течение 5 минут.
   7. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте бактериальную гранулу в 150 мкл 5% BB.
6. Окрашивание антителами
   1. Приготовьте свежие 5% BB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с использованием флуоресцентно меченного антитела должны выполняться в темноте, а антитела, BB и FCSB должны храниться на льду.
   2. Развести антитела к норовирусу человека GII в соотношении 1:125 для образцов E. cloacae и 1:150 для образцов L. gasseri в 5% ВВ, получая 50 мкл разведенного антитела на образец.
   3. Разбавляют антитело изотипа таким же образом, как антитело к норовирусу человека GII разводили для каждой бактерии в 5% ВВ, получая 50 мкл разбавленного контроля изотипа на образец.
   4. Разделите каждый образец для анализа с насадки на шаге 1.3.7 на три аликвоты по 50 мкл, переложив их в чистые центрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
   5. К первому набору образцов добавьте 50 μL BB. Этот набор будет неокрашенным (Uns) управлением.
   6. Добавьте 50 мкл разведения антител GII ко второму набору. Это приводит к тому, что конечная концентрация антител составляет 1:250 для E. cloacae и 1:300 для L. gasseri. Этот набор образцов будет окрашенными (AB) образцами.
   7. Добавьте 50 мкл разведенного антитела изотипа к третьему набору. Этот набор будет управляться изотипом (IC). Хорошо перемешайте с помощью пипетки. Инкубируйте образцы на льду и в темноте в течение 30 минут.
   8. Центрифугируйте все образцы при давлении 10 000 x g в течение 5 минут.
   9. Отбраковать надосадочную жидкость и повторно суспендировать образцы в 100 мкл FCSB.
   10. Центрифугируйте все образцы при давлении 10 000 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте образцы в 100 мкл FCSB.
   11. Центрифугируйте все образцы при давлении 10 000 x g в течение 5 минут.
   12. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте образцы в 150 мкл FCSB.
   13. Перенесите каждый образец в пробирку FCSB, содержащую 400 мкл буфера FCSB общим объемом 550 мкл.
   14. Храните образцы при температуре 4 °C до тех пор, пока они не будут проанализированы с помощью проточной цитометрии.
       заметка: Проточную цитометрию проводят в течение 4 ч после окрашивания антителами.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5 мл полистроновые тубы с круглым дном и крышкой для ячеек-ситечков	Корнинг	352235	После окрашивания антителами образцы перекладывают в пробирки для анализа проточной цитометрии.
АнаэроПак	Термо Сайентиал	R681001	Анаэробный газовый тампонаж используется для культивирования Lactobacillus gasseri
Программное обеспечение BD FacsDiva
Проточный цитометр BD LSR Fortessa
Бычий сывороточный альбумин	Биореагенты Фишера	БП1605	Используется для проточной цитометрии
Буфер для окрашивания проточной цитометрии (FCSB)	BD Biosciences	554657	Используется для проточной цитометрии
Мышь IgG2b каппа контроль изотипа (eBMG2b), ПЭ, eBioscience	Thermo Fisher Scientific	12473281	Контроль изотипа. Это антитело приобретается в конъюгированной форме у производителя.
Порошок MRS	BD Biosciences	No 288130 (Английский	Используется для приготовления сред и культивирования Lactobacillus gasseri.
Моноклональное антитело к норовирусному капсиду G2 (L34D)	Thermo Fisher Scientific	МА5-18241	Антитела к норовирусу GII. Это антитело доступно только в неконъюгированной форме и, таким образом, должно быть конъюгировано флуоресцентно перед использованием в описанных анализах проточной цитометрии. В этом протоколе ПЭ был выбран фтор, однако другие флуоресцентные молекулы могут быть выбраны как наиболее подходящие для проточного цитометра, используемого исследователем.
Норовирус GII.4 VLP	Творческая биоструктура	КБС-В700	Вирус норовируса человека, похожий на частицу, VLP были получены с использованием бакуловирусной системы и ресуспендированы в фосфатно-солевом буфере с 10% глицерина. Авторы провели независимый анализ слежения за наноприцелом для определения концентрации частиц VLP. Концентрация составляет примерно 1011 VLP на миллилитр. В зависимости от концентрации белка VLP в анализах прикрепления VLP к каждой бактерии добавляется около 200 частиц
ПБС 10Х	Биореагенты Фишера	БП665	Разбавьте до 1X перед использованием.
Набор для мечения антител SiteClick R-PE	Thermo Fisher Scientific	С10467	Набор для конъюгации, используемый для лабораторного анализа неконъюгированных антител.
Хлорид натрия	Научный центр Фишера	С271	Используется для подготовки среды
Триптон	Оксоидный	ЛП0042	Используется для подготовки среды
Трубчатый револьвер	ThermoFisher Scientific	88881001	Используется в анализе на вирус: бактериальное прикрепление. Установите максимальную скорость (40 об/мин).
Дрожжевой экстракт	BD Biosciences	No 212750	Используется для подготовки среды
агар	сигма	А7002	Используется для подготовки среды

) .