1. Обнаружение митофагии у C. elegans
ПРИМЕЧАНИЕ: Нематода C. elegans предоставляет платформу для анализа митофагии на уровне организма. Для мониторинга митофагии можно использовать два штамма: (1) митохондриально-целевую розеллу (mtRosella) или (2) рецептор митофагии DCT-1, слитый с GFP вместе с аутофагосомным маркером LGG-1, слитым с Discosoma sp. красный флуоресцентный белок (DsRed).
- Мониторинг митофагии с помощью биосенсора Rosella
ПРИМЕЧАНИЕ: Rosella — это молекулярный биосенсор, который сочетает в себе pH-нечувствительный DsRed, слитый с pH-чувствительным вариантом GFP. Биосенсор Rosella использует разницу pH между кислой лизосомой (pH ~4,5) и другими клеточными компартментами. Этот биосенсор использовался для успешного мониторинга митофагии у Saccharomyces cerevisiae и нескольких клеточных линий млекопитающих, таких как HeLa, HEK293 и HCT116. Мы адаптировали этот универсальный двойной флуоресцентный репортер и создали трансгенные нематоды C. elegans, экспрессирующие митохондриальную розеллу (mtRosella) в мышечных клетках стенки тела. Индукция митофагии проявляется в снижении соотношения GFP/DsRed флуоресценции mtRosella.
- День 1: Выберите личинки L4 червей, экспрессирующих митохондриальную розеллу (mtRosella) в мышечных клетках стенки тела на пластину для роста нематод (NGM), засеянную E. coli (OP50), с помощью микроскопа для препарирования. Поместите 10-20 червей на тарелку по крайней мере на три пластины по 3,5 см. Инкубировать нематод при стандартной температуре 20 °C.
заметка: Смотрите справочную информацию по анатомии червей, включая идентификацию личинок L4 и способ сделать кирку, которая используется для переноса червей из одного места в другое.
- День 5: Синхронизируйте нематод, выбрав 15-20 трансгенных личинок L4 и перенеся их на свежую пластину OP50, засеянную NGM. Используйте не менее пяти планшетов для каждого экспериментального условия.
- День 7: Подготовьте номерные знаки автомобиля для препаратов, влияющих на митофагию, представляющих интерес или положительный контроль.
- Убейте бактерии E. coli (OP50), посеянные путем воздействия на планшеты NGM в течение 15 минут ультрафиолетовым светом с интенсивностью 222 μВт/см2, чтобы гарантировать, что соединения, индуцирующие митофагию, не метаболизируются бактериями. Плиты должны быть экспонированы с давлением 2 000 Дж/м2,<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимое количество секунд экспозиции = 2,000/((интенсивность в мкВт/см2)*100).
- Добавьте интересующее вас соединение (соединения) в верхнюю часть засеянных пластин NGM. Добавьте эквивалентное количество компаунда транспортного средства (растворителя, используемого для растворения соединения, такого как диметилсульфоксид (ДМСО)) на пластины транспортного средства в качестве отрицательного контроля. Для положительного контроля индукции митофагии использовали митохондриальный токсикант паракват (конечная концентрация 8 мМ). Добавьте раствор, содержащий 10 мкл 8 М параквата и 190 мкл ddH2O на верхнюю часть агаровой пластины для группы обработки. Для группы транспортных средств добавьте раствор, содержащий 10 мкл ДМСО и 190 мкл ddH2O на верхнюю часть агаровой пластины.
заметка: Рабочий раствор параквата можно хранить в течение 1 месяца при температуре 4 °C.
- Аккуратно поворачивайте пластины, пока лекарство или средство не покроют всю поверхность. Дайте пластинам высохнуть при закрытых крышках при комнатной температуре не менее 1 часа перед переносом червей.
заметка: Планшеты для лекарств также могут быть приготовлены путем добавления лекарств в жидкий NGM до того, как он затвердеет.
- День 7: Переведите 10-20 2-дневных взрослых трансгенных животных, приготовленных на шаге 2.1.2, в тарелки, содержащие либо паракват, либо представляющие интерес соединения или носители (ДМСО). Инкубируйте трансгенных животных при 20 °C в течение 2 дней.
- День 9: Приготовьте 2% агарозные подушечки. Затем добавьте одну каплю (10 μл) 20 мМ левамизола в M9 на каждую подушечку. Иммобилизуйте трансгенных животных для визуализации, поместив их в каплю M9-левамизол. Аккуратно положите сверху покровную крышку.
- Захват одиночных трансгенных животных с помощью камеры, прикрепленной к эпифлуоресцентному микроскопу. Получите флуоресцентные изображения целых трансгенных нематод, экспрессирующих мтрозеллу в мышечных клетках стенки тела при 10-кратном увеличении. Сохраните собранные изображения.
- Обрабатывайте полученные изображения с помощью программного обеспечения ImageJ. Проанализируйте мышечные клетки стенки тела, расположенные в голове червя, чтобы избежать аутофлуоресценции в кишечной ткани. Измерьте среднее значение интенсивности пикселей и общую площадь для каждого флуоресцентного изображения только области головы каждого животного. Чтобы проанализировать конкретную область интересов:
- Выберите «разделенный канал» в выпадающем меню «изображение» и «цвет» для преобразования изображений.
- Используйте инструмент «Выделение от руки», чтобы захватить флуоресцентную область интереса.
- Выберите команду «измерение» в выпадающем меню «анализ» и выполните анализ интенсивности пикселей.
- Интенсивность пикселей следует нормализовать путем деления интенсивности на общую анализируемую площадь. После нормализации рассчитайте отношение GFP к DsRed.
- Используйте программное обеспечение для статистического анализа для проведения t-критерия Стьюдента (сравнение между двумя группами) или ANOVA (сравнение между несколькими группами) для статистического анализа с p < 0,05 как значимым.
- Оценка митофагии с помощью кололокализации между DCT-1 и LGG-1
DCT-1 является белком внешней митохондриальной мембраны, который действует как рецептор митофагии в ответ на стрессовые условия, подобно его предполагаемым ортологам BNIP3 и NIX/BNIP3L у млекопитающих. Таким образом, инициацию митофагии оценивают по колокализации между рецептором митофагии DCT-1 и белком аутофагосомной мембраны LGG-1 (гомологом LC3 млекопитающих).
- День 1: Выберите личинки L4 трансгенных животных, экспрессирующие как DCT-1::GFP, так и DsRed::LGG-1 в мышечных клетках стенки тела5 на планшете OP50, засеянном NGM. Поместите 5-10 червей на 3,5 см пластины и используйте не менее трех пластин. Инкубировать нематод при температуре 20 °C.
заметка: Трансгены расположены на отдельных плазмидах и не интегрированы в геном. Подберите нематод, несущих маркеры конактивации rol-6(su1006) и pmyo-2 GFP. Только трансгенные черви с обоими маркерами контрансформации экспрессируют как DCT-1::GFP, так и DsRed::LGG-1 в мышечных клетках стенки тела.
- Выполните действия, описанные в пунктах 1.1.2-1.1.5.
- Визуализируйте отдельные мышечные клетки стенки тела с помощью камеры, прикрепленной к конфокальному микроскопу. Определяйте границы всех мышечных клеток стенки тела и делайте z-стековые изображения с 63-кратным увеличением. Также можно использовать более высокое увеличение.
- Открывайте и обрабатывайте изображения, полученные с помощью конфокального программного обеспечения. На инициацию митофагии указывает ко-кализация рецептора митофагии (DCT-1::GFP) к аутофагосомному маркеру (DsRed::LGG-1). Вручную измеряйте события колокализации в каждой стопке мышечных клеток стенки тела. Важно поддерживать все настройки микроскопа и камеры (объектив и лупа, фильтры, время экспозиции, разрешение, интенсивность лазера, усиление и т. д.) на протяжении всего эксперимента. Все настройки должны быть учтены.
- Используйте программное обеспечение для статистического анализа для проведения t-критерия Стьюдента (сравнение между двумя группами) или ANOVA (сравнение между несколькими группами) для статистического анализа с p < 0,05 в качестве значимого. Для двухсторонних сравнений используйте t-критерий Стьюдента (p < 0,05 считается значимым). Для множественных сравнений используйте однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), скорректированный апостериорным критерием Бонферрони. Мы рекомендуем анализировать не менее 50-70 животных или 30-50 мышечных клеток стенки тела для каждого экспериментального условия. Повторите эксперимент не менее трех раз.
