Капиллярный электрофорез для выявления биомаркеров белка

Аннотация

Источник: Sage, J. M., et al. Использование иммуноферментного анализа капиллярного электрофореза для поиска потенциальных биомаркеров бокового амиотрофического склероза в тромбоцитах человека.J. Vis. Exp.(2020)

Это видео демонстрирует протокол иммуноферментного анализа капиллярного электрофореза для обнаружения белкового биомаркера, связанного с боковым амиотрофическим склерозом (БАС) из тромбоцитов крови человека. Подтверждение наличия белка-биомаркера ALS достигается путем разделения тромбоцитарных белков по размеру с последующим детектированием хемилюминесцентных клеток.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Приготовление буферов и реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все образцы в соответствии с рекомендациями производителя. Во время этой процедуры надевайте средства индивидуальной защиты (лабораторные халаты, перчатки и защитные очки).

1. Приготовьте цитратный промывочный буфер, соединив 0,941 г сахарозы (конечная концентрация 11 мМ), 6,4 мл 5 М натрия хлорида (NaCl, 128 мМ конечная), 5,4 мл 0,2 М мононатрийфосфата (₂PO₄, 4,3 мМ конечная), 9,4 мл 0,2 М динатрийфосфата (Na₂HPO₄, 7,5 мМ конечная), 0,352 г цитрата натрия (4,8 мМ конечная), и 0,115 г лимонной кислоты (2,4 мМ конечная). Отрегулируйте общий объем до 250 мл с помощью ddH₂O. Отфильтруйте через фильтрующий диск 0,45 мкм и отрегулируйте pH до 6,5. Хранить до 1 года при температуре 4 °C. Перед использованием доведите раствор до комнатной температуры (RT).
2. Приготовьте буфер для разрыва, соединив 250 мМ сахарозы, 1 мМ этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 10 мМ трис (гидроксиметил)аминометана гидрохлорида (Tris-Cl, pH 7,4) в конечном объеме 100 мл. Хранить до 1 года при температуре 4 °C. Добавьте 2 мкл коктейля ингибиторов фосфатазы (1:1000 final) и 1 мкл коктейля ингибиторов протеазы (1:2000 final) в 2 мл буфера для разрыва. Держите на льду до использования. Выбросьте неиспользованный буфер разрыва.

2. Выделение тромбоцитов

1. Соберите 8–10 мл человеческой крови в пробирку для сбора крови с желтой крышкой, содержащую раствор цитрата кислоты и декстрозы (АЦД) (75 мМ тринатрия цитрата, 124 мМ декстрозы и 38 мМ лимонной кислоты, рН = 7,4; ACD: кровь = 1:9). Аккуратно перемешайте содержимое пробирки в 5–6 раз, переворачивая вручную.
2. Центрифугируйте пробирки при давлении 200 x g в качающемся роторе ведра в течение 20 мин при RT.
3. Соберите обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) (~3–4 мл) в коническую нижнюю пробирку объемом 15 мл и оставьте примерно 0,5 мл PRP из охристой оболочки (туманной фракции), чтобы избежать загрязнения. Если произошло заражение эритроцитами, повторите этот шаг.
4. Центрифугируйте образцы PRP при давлении 1 200 x g в течение 15 минут в режиме RT.
5. Промойте тромбоцитарные гранулы (P1) путем щадящей ресуспензии в 1 мл буфера для промывки цитрата и гранулы центрифугированием при 1 200 x g в течение 15 минут при RT.
6. Сохраните чистые тромбоцитарные гранулы. Выбросьте надосадочную жидкость.
7. Ресуспендируйте тромбоцитарные гранулы в 600 мкл буфера разрыва, содержащего ингибиторные коктейли.
8. Произведите ультразвуковую обработку тромбоцитарной суспензии с помощью ультразвуковой обработки. Поместите образец в мини-ведерко со льдом. Установите ультразвуковой аппарат в положение 3 на 20 с в непрерывном режиме.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите зонд 10% отбеливателем, а затем дистиллированной водой.
9. Центрифугируйте обработанные ультразвуком образцы при температуре 20 000 x g в течение 30 минут при 4 °C для удаления мембранных фракций. Аликвотные надосадочные жидкости в 60 мкл и хранить при температуре -80 °C. Избегайте повторных циклов размораживания / замораживания цитозольных фракций тромбоцитов.

3. Подготовка к иммуноферментному анализу с капиллярным электрофорезом (CEI)

ПРИМЕЧАНИЕ: 100 мкл лизата тромбоцитов человека были объединены у пациентов с БАС (n = 8–10), а здоровые субъекты (n = 8–10) были отдельно объединены и использованы для оптимизации анализа.

1. Заполните собственные шаблоны для макета CEI (Таблица 1) и подготовки образцов (Таблица 2). Таблица подготовки смеси образцов является динамической и автоматически рассчитает, какой объем необходимо удалить из источника.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда требуемый объем источника введен в динамическую таблицу 2, объем буфера 0,1 X будет автоматически рассчитан
.
2. Предварительно промаркируйте 25 ПЦР-пробирок объемом 0,2 мл с капиллярами #1–#25 и поместите их в штатив для ПЦР. Поставить на лед.
3. Предварительно промаркируйте микроцентрифужные пробирки объемом 0,6 мл: по одной для каждого используемого первичного антитела и разведения (при необходимости), одной для буфера для образца 0,1x, одной для люминола-S/пероксида и по одной для каждого разбавляемого образца (при необходимости). Поместите их на лед в решетку для трубок.
4. Извлеките буфер для проб, буфер для промывки, одну пластину и картридж, входящий в комплект разделения CEI 12–230 кДа.
5. Достаньте из холодильника при температуре 4 °C буфер для разведения антител, первичные антитела, вторичные антитела, люминол, перекись водорода и стандартную упаковку. Поместите на лед все реагенты, кроме стандартной упаковки, которая остается по адресу RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реактивы из стандартных упаковок лиофилизируются и запечатываются фольгированным покрытием. Чтобы уменьшить потери продукта, перед открытием их следует кратковременно раскрутить с помощью мини-центрифуги. Чтобы открыть, пробирки с реагентом можно проткнуть наконечником пипетки или оттянуть назад от угла.
6. Для приготовления дитиотреитола (ДТТ) в дозе 400 мМ добавьте 40 мкл деионизированной воды в прозрачную пробирку, содержащую ДТТ.
7. Чтобы приготовить 40 мкл флуоресцентной 5x мастер-смеси, добавьте 20 мкл буфера для образца 10x и 20 мкл приготовленного 400 мМ раствора DTT в розовую пробирку, входящую в комплект.
8. Чтобы приготовить биотинилированный трап, добавьте 16 мкл деионизированной воды, 2 мкл 10-кратного буфера для проб и 2 мкл приготовленного 400 мМ раствора DTT в белую пробирку, входящую в комплект. Аккуратно перемешайте и переложите в пробирку для полимеразной цепной реакции (ПЦР) объемом 0,2 мл для денатурации.
9. Приготовьте 0,1x буфер для образца, добавив 1,5 мкл 10x буфера для образца и 148,5 мкл деионизированной воды в микроцентрифужную пробирку объемом 0,6 мл. Вихрь перемешать и выложить на лед.
10. Приготовьте нужные разведения антител. Добавляйте разбавитель антител в объемах, предназначенных для каждой предварительно помеченной микроцентрифужной пробирки. Если объемы идентичны, используйте технику обратного пипетирования; Если нет, предварительно промойте наконечник пипетки перед выдачей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном анализе использовали пан-антитело A-TDP-43 и антитело a-p(S409/410-2) TDP-43. Антитела против ERK использовались для внутреннего контроля, чтобы убедиться в работоспособности компонентов анализа.
11. Выполните обратное пипетирование для разведения антител, как описано ниже. Кроме того, дополнительную информацию можно найти в литературе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратное пипетирование предпочтительно при дозировании небольших последовательных объемов растворов. Этот метод имеет ряд преимуществ: (i) обеспечение точного объема, (ii) устранение пенообразования реагента в отверстии наконечника и (iii) идеально подходит для реагентов небольшого объема (<5 мкл), вязких растворов, растворов поверхностно-активных веществ и растворов с высоким давлением пара.
    1. Вставьте нужный наконечник в пипетку и нажмите на поршень до второго упора (Шаг 2). Погрузите наконечник пипетки на несколько миллиметров в раствор. Медленно отпустите поршень, чтобы заполнить наконечник пипетки раствором, пока наконечник все еще погружен. Извлеките наконечник из раствора и осторожно коснитесь края резервуара с реагентом, чтобы удалить лишнюю жидкость, оставшуюся на внешней стороне наконечника.
    2. Дозируйте раствор, нажав на поршень до первого упора (шаг 1). Не выдавайте остатки раствора в наконечнике.
    3. Слейте оставшийся раствор в наконечнике в резервуар с реагентом, нажав на поршень до второго упора (Шаг 2). Отпустите поршень в исходное положение для следующего этапа пипетирования.
    4. Добавьте необходимое антитело в объемах, предназначенных для каждой предварительно помеченной микроцентрифужной пробирки (Таблица 1). Не промывайте предварительно наконечник пипетки: добавьте его непосредственно в разбавитель и промойте наконечник несколько раз, чтобы удалить антитела. Поместите трубки на лед.
12. Чтобы приготовить смесь образцов CEI, выполните шаги, перечисленные ниже для ПЦР-пробирок с маркировкой cap#2 - cap#25: Это в том же порядке, что и в таблице 1.
    1. Откройте все пробирки, добавьте 1,6 мкл аликвот флуоресцентного 5-кратного буфера для проб в каждую пробирку, используя метод обратного пипетирования, затем закройте каждую ПЦР-пробирку после добавления 5-кратного буфера, чтобы свести к минимуму потерю пробы.
    2. Откройте все пробирки, добавьте в каждую пробирку 0,1x буфер для образцов в объемах, указанных в таблице 2, и сразу же закройте. Если объемы идентичны, используйте метод обратного пипетирования. Если нет, предварительно промойте наконечник пипетки перед дозированием 0,1x буфера для пробы.
    3. Откройте все пробирки, добавьте в каждую пробирку образец белка в объемах, указанных в таблице 2, затем сразу же закройте. Если объемы идентичны, используйте технику обратного пипетирования. Если нет, предварительно промойте наконечник пипетки перед дозированием 0,1x буфера для пробы.
    4. Кратковременно центрифугируйте все ПЦР-пробирки в настольной центрифуге (13 000 x g в течение 30 с), перемешайте ПЦР-пробирки и повторите центрифугирование.
    5. Переложите все ПЦР-пробирки в амплификатор с подогреваемой крышкой. Денатурация образцов при определенной температуре и продолжительности (т.е. 95 °C в течение 5 мин; 70 °C в течение 10 мин).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Температура и продолжительность денатурации должны быть оптимизированы для целевого белка.
    6. Повторите шаг 3.12.4.
    7. Верните все ПЦР-пробирки на штатив для пробирок и положите их на лед.
    8. На этапе денатурации приготовьте раствор для проявления (1:1 люминол-S: раствор перекиси), затем добавьте 200 μL люминола-S и 200 μL перекиси. Выложите на лед.
    9. Чтобы загрузить предварительно заполненную CEI пластину с образцом, подготовленным выше, распределите реагенты и образцы в пробирную пластину, показанную на схеме анализа (Рисунок 1). Избегайте попадания пузырьков воздуха.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если объемы и раствор идентичны, используйте метод обратного пипетирования. Если нет, предварительно промойте наконечник пипетки перед дозированием и не выбрасывайте остатки в планшет с помощью второго ограничителя на пипетке. Модуль разделения 12–230 кДа может содержать направляющую загрузки пластин с цветовой кодировкой. Поместите эту направляющую под пластину во время добавления реагентов и образцов в лунку, что визуально поможет при загрузке образцов. Руководство по загрузке плит также можно скачать с веб-сайта компании.
       1. добавить 15 мкл люминола: перекись смешать в каждую лунку в ряду Е. <бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале приготовьте этот реагент непосредственно перед использованием и добавляйте его в каждую лунку. Если это неудобно, то эту смесь можно готовить не более чем за 30 минут до загрузки плит.
       2. В ряду D, в лунку D1, добавить 10 мкл стрептавидина-HRP.
       3. В ряд D, в лунки D2–D25, добавить 10 мкл назначенного вторичного антитела.
       4. В строку В добавьте по 10 мкл разбавителя антител в каждую лунку.
       5. В строку С, в лунку С1, добавляют 10 мкл разбавителя антител.
       6. В ряд С в лунки С2–С25 добавить 10 мкл назначенного первичного антитела.
       7. В ряд А, в лунку А1, добавьте 5 μл биотинилированного лестничного раствора из ПЦР-пробирки #1.
       8. В ряд А, в лунки А2–А25, добавить 3 мкл образца, ПЦР-пробирки #2–#25 в соответствующие лунки #2–#25.
       9. Добавьте 500 мкл промывочного буфера в каждую предназначенную для промывки лунку.
       10. Центрифугируйте планшет в течение 5 минут при 1 000 x g при RT.

Таблица 1: Шаблон загрузки пробирной пластины CEI.

Таблица 2: Интерактивный шаблон приготовления смеси образцов. После ввода исходной концентрации белка из неизвестных образцов интерактивные ячейки автоматически рассчитают, какой объем должен быть использован для приготовления смеси образцов.

Результаты

Рисунок 1: Схема пробирного анализа.В одном анализе можно провести оптимизацию как первичного антитела, так и образца целевого белка. Капилляры 2–7, 8–13, 14–19 и 20–24 представляют различные концентрации белка и диапазоны первичных антител. Капилляр 25 представляет собой положительный контроль. Использовали антитела к ERK; Тем не менее, может быть включен любой соответствующий положительный контроль...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12-230 кДа Комплект для разделения	БелокПростой	СМ-В004	Содержит предварительно заполненную пробирную пластину и 25-канальный капиллярный картридж
Амплификатор 3000G	Техне	ФТК3G/02	Мы использовали этот термоциллер для нагрева образца смеси
Комплект для обнаружения мышей	БелокПростой	042-205	Включает HRP-конъюгированное вторичное антитело, буфер, люминоловый реагент, маркер молекулярной массы
Антитела Anti-P(S409-410) TDP-43	ПротеинТек	22309-1-АП	Первичное антитело, распознающее фосфорилированный TDP-43
Антитела Anti-P(S409-412) TDP-43	КосмоБио-США	TIP-PTD-P02	Первичное антитело, распознающее фосфорилированный TDP-43
Комплект для обнаружения кроликов	БелокПростой	ДМ-001	Включает HRP-конъюгированное вторичное антитело, буфер, люминоловый реагент, маркер молекулярной массы
Антитела Anti-TDP-43 (pan)	ПротеинТек	10782-2-АП	Первичное антитело, распознающее целый белок TDP-43
Звуковой дисмембранор; Модель100	Научный центр Фишера		Ультразвуковая аппаратура. Используется для разрыва клеточной мембраны. Данная модель снята с производства (Модель XL2000-350)
Настольная центрифуга	Эппендорф	22625004	Модель # 5810 с ковшом с качающейся пластиной
Анализатор Уэса	БелокПростой	55892-WS-2203	Проводит капиллярный гель-электрофорез
Компас для SimpleWestern (SW)	БелокПростой	Версия 4.0.0.	Compass for SW — это приложение для управления и анализа данных для приборов SimpleWestern