Методическая статья

Иммуноферментный анализ на основе магнитных наночастиц с использованием микрофлюидного устройства

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Hernández-Ortiz, J. A., et al. Компьютерное численное управление микрофлюидным акриловым устройством с ступенчатым ограничением для иммунологических анализов на основе магнитных наночастиц. J. Vis. Exp. (2022).

Это видео демонстрирует микрофлюидную систему для иммуноферментного анализа на основе магнитных наночастиц. В системе обнаружения используется микрофлюидное устройство, содержащее магнитную ловушку в своих каналах. В каналы вводят предварительно сформированные иммунокомплексы, состоящие из покрытых антигеном магнитных наночастиц, связанных с первичными и пероксидаза-конъюгированными вторичными антителами. При воздействии внешнего магнитного поля иммунокомплексы захватываются в пористую магнитную ловушку. С помощью флюорогенного субстрата, излучающего флуоресценцию при катализе пероксидазами, захваченные иммунокомплексы детектируются под микроскопом.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка устройства

  1. Наполните каналы дистиллированной водой с помощью шприца. Убедитесь в отсутствии утечек или сопротивления потоку. Погрузите устройство в ультразвуковую ванну на 10 минут, чтобы удалить остатки акрила, клея или нежелательных материалов внутри каналов.
  2. Слейте воду внутрь каналов устройства. С помощью шприца введите блокирующий раствор, приготовленный из 5% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA), разведенного в 1x трис-буферизованном физрастворе (TBS) и предварительно отфильтрованного через шприцевой фильтр 0,2 мкм из полиэфирсульфона (PES).
  3. Приготовьте суспензию микрочастиц железа диаметром 7,5 мкм в 5% БСА.<бр/> заметка: Микрочастицы предварительно функционализируются слоем диоксида кремния и полиэтиленгликоля (ПЭГ), который придает устойчивость к поглощению белка.
  4. Инкубируйте чип и суспензию микрочастиц с блокирующим раствором не менее 1 ч при комнатной температуре. По возможности дайте засорению на ночь при температуре 4 °C.

2. Образование ловушки микрочастиц

  1. Введите микрочастицы в чип с помощью иглы шприца через выходной шланг бокового канала. Поместите чип вертикально и позвольте микрочастицам под действием силы тяжести протекать через боковой канал. Поверните микросхему на 180° в два этапа по 90° и позвольте микрочастицам нацелиться и уплотниться при ограничении 5 мкм.
  2. Удалите излишки микрочастиц под действием силы тяжести, вращаясь на 45° в сторону бокового канала.
  3. Держите устройство в вертикальном положении, чтобы не расстегнуть ловушку микрочастиц. На рисунке 1B приведена краткая информация о процессе образования микрочастиц
    4. .

3. Иммунологический анализ

  1. Подготовка наночастиц
    1. Берут 2 мкл суспензии наночастиц длиной 100 нм, предварительно конъюгированных с лизоцимом (модель антигена). Добавьте его в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл со 100 мкл блокирующего раствора. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
    2. Добавьте 150 мкл буфера для стирки (1x TBS, 0,05% Tween 20).
    3. Поместите микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл в магнитный сепаратор. Оставьте на 15 минут, чтобы дать возможность отделить наночастицы (Рисунок 2).
      заметка: Минимальный объем магнитного сепаратора составляет 200 μл. Избегайте использования меньшего объема.
    4. Удалите жидкость из пробирки с помощью микропипетки. Избегайте контакта со стенкой трубки, где образовалась гранула наночастицы.
    5. Добавьте 250 μL свежего буфера для стирки. Держите пробирку под перемешиванием в течение 15 минут.
    6. Повторите шаги 3.1.3.-3.1.5. Еще 2 раза, встряхивая всего 5 минут.
    7. Добавьте желаемую концентрацию первичного антитела к лизоциму (см. Таблицу материалов). Доведите конечный объем до 100 мкл в разбавителе антител (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
    8. Выдерживать в течение 15 минут при температуре 37 °C. Выдерживать при встряхивании еще 15 минут при комнатной температуре.
    9. Повторите шаги стирки 3.1.2.-3.1.6.
    10. Добавьте 100 мкл разбавителя антител. Добавьте вторичное антитело, связанное с пероксидазой хрена (HRP-AbII) (см. Таблицу материалов) в разведении 1:500.
    11. Повторите шаги стирки 3.1.2.-3.1.6.
    12. Храните наночастицы в конечном объеме 50 мкл разбавителя антител.

4. Экспериментальный монтаж

  1. Наполните два стеклянных шприца объемом 100 мкл водой, подсоедините к каждому шприцу шланг длиной 6,5 см, вставьте металлический штифт в конец шланга и поместите оба шприца на шприцевой насос с компьютерным управлением.
  2. Загерметизируйте все шланги акрилового устройства теплом.
  3. Перережьте наливной шланг и оставьте всего несколько миллиметров. Наполните дозирующую иглу промывочным буфером и вставьте его в разрезанный шланг. Перед подключением иглы к устройству дайте раствору стечь, чтобы предотвратить доступ воздуха к устройству.
  4. Отрежьте выходной шланг от бокового канала. Подсоедините к шприцевому насосу. Далее проделайте ту же процедуру для выходного шланга основного канала.
    заметка: Ключевым является выполнение пунктов 4.3.-4.4. Для этого необходимо избежать распаковки ловушки микрочастиц. Если есть возможность, проверьте состояние ловушки во время этих действий с помощью лупы.
  5. Поместите предметное стекло на предметное стекло на предметный столик микроскопа. Прикрепите магнит к предметному стеклу с помощью двустороннего скотча и поместите небольшой кусочек скотча с каждой стороны, чтобы зафиксировать края скола к стеклу.
  6. Установите расход 50 μл/ч с помощью вкладок Расход и Единицы измерения в контроллере шприцевого насоса. Выберите режим Вывод и нажмите кнопку Пуск, чтобы активировать подачу буфера промывки.
  7. Осторожно подойдите к предметному стеклу с помощью магнита горизонтально так, чтобы область чипа, содержащего ловушку, соприкасалась с магнитом.
  8. Приклейте края устройства к стеклу двусторонним скотчем, чтобы предотвратить перемещение. Избегайте загораживания оптического пути для микроскопии (рис. 1C).

5. Иммунодетектирование

  1. Поддерживайте поток промывочного буфера в течение 10 минут со скоростью 50 мкл/ч, чтобы удалить излишки BSA.
  2. Удалите остатки буфера для промывки с дозирующей иглы с помощью микропипетки. Добавьте 50 μл суспензии наночастиц.
  3. Протекайте суспензию наночастиц в течение 7 мин со скоростью потока 100 мкл/ч. Впоследствии измените расход на 50 μл/ч и расходуйте еще 15 минут.
  4. Смените дозирующую иглу. Полейте промывочный буфер в течение 10 минут со скоростью 50 μл/ч. Подготовьте флуорогенный субстрат в соответствии со спецификациями производителя на этапе промывки.
  5. Удалите остатки буфера для промывки с дозирующей иглы с помощью микропипетки. Добавьте 100 μL флуорогенного субстрата (см. Таблицу материалов). Налейте флуорогенный субстрат в течение 6 минут со скоростью 50 мкл/ч.
  6. Задайте параметры измерения расхода (1 мкл/ч, 3 мкл/ч, 5 мкл/ч и 10 мкл/ч) и времени (6 мин) на соответствующих вкладках «Расход» и «Установите таймер» интерфейса, управляющего шприцевым насосом. Обязательно выберите Режим снятия для каждого из выполняемых измерений.
  7. Установите дополнительную вкладку «Расход» на 50 μл/ч и установите таймер на 3 минуты для этапа стирки.
  8. Включите флуоресценцию микроскопа за 15 с до остановки подложки при давлении 50 мкл/ч. Начните съемку с помощью программного обеспечения камеры микроскопа за 10 секунд до остановки подложки с временем экспозиции 1 000 миллисекунд. Выполняйте визуализацию в течение 6 минут со скоростью 1 кадр/с (FPS).
  9. Нажмите на кнопку «Пуск» нужного параметра расхода сразу после того, как скорость промывки основания на уровне 50 мкл/ч прекратится. Нажмите на кнопку «Старт» потока стирки (50 μл/ч) сразу после окончания выбранного измерительного потока.
  10. Остановите захват изображения и выключите флуоресценцию микроскопа, чтобы избежать фотообесцвечивания подложки.
  11. Повторяйте шаги 5.8.-5.10 для каждого используемого расхода измерения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Окончательная конфигурация устройства. (A) Акриловое устройство со шлангами, прикрепленными к соответствующим входам и выходам. На шкале указаны размеры устройства в сантиметрах. (В) Протокол формирования ловушки микрочастиц. Микрочастицы проходят по каналу под действием силы тяжести, когда устройство находится в вертикальном положении. Микрочастицы концен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микрочастицы карбонильного железаСигма-ОлдричНомер 448907 мкм
хлороформФермонтНомер 6201Опасность для здоровья: Умеренная< чел/> Воспламеняемость: Нет<бр /> Реакционная способность: Нет<бр /> Опасность контакта: Умеренная
CMOS-камера МоментФотометрика TeledyneСенсорная технология: CMOS
Квантовый КПД: 73%<бр/> Размер пикселя: 4,5 мкм x 4,5 мкм<бр /> Поддерживаемые интерфейсы: USB 3.2 Gen 2
Программное обеспечение Dr EngraveКорпорация Roland DGAПрограммное обеспечение для гравировки для проектирования и создания траектории гравировки на поверхности
Вытяжной колпакнеизвестныйнеизвестный
Гибкие пластиковые трубкиТайгонAAD04103ИД = 0,020, ОД = 0,060
Флуоресцентный микросопЦЕЙССAxio Vert.A1
Высокоточная игла для дозированияЛоктит98612
Разделительный стеллаж MagJETтеплонаучные12 x 1,5 мл
Полиметилметакрилат - Лист - ПММА, акрилГудфеллоуME303018/1Толщина: 1,3 мм, Прозрачность: Прозрачная
Программное обеспечение PVCamTestФотометрика TeledyneВерсия 3.10.107Программное обеспечение для получения изображений
СтереомикроскопКомпания NikonСМЗ 7457
Карбоксиловые бусины SuperMagОкеан НаноТехKSC0100100 нм
Шприцевой насосkd ScientificКДС200Вмещает до двух шприцев
Утразвуковая ваннаБрэнсон2800
Программное обеспечение VPanelОС WindowsВерсия 1.0.3.0Программное обеспечение для управления микрофрезерным станком
г.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Magnetic Nanoparticle ImmunoassayImmunocomplex DetectionMagnetic TrapFluorogenic SubstratePeroxidase ConjugationFlow Rate ControlFluorescence MicroscopyChannel RestrictionBSA Blocking

Похожие статьи