$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ПРИМЕЧАНИЕ: На этих этапах использовалась клеточная линия рака яичников, OVCAR3, но этот протокол широко применим ко многим другим клеточным линиям, включая те, которые получены из источников, не относящихся к яичникам. Схема протокола показана на рисунке 1.
1. Покрытие ячеек
- Изготовьте покровные стекла с покрытием из поли-L-лизина.
- Добавьте автоклавные покровные стекла диаметром 12 мм в коническую трубку объемом 50 мл с раствором поли-L-лизина и поставьте на коромысло на 15 минут.
- Аспирируйте раствор в вытяжке для культуры тканей. Промойте покровные стекла, добавив стерильную воду, и поместите трубку с покровными стеклами обратно на коромысло на 5 минут. Повторите этот шаг стирки три раза.
- Разложите покрытые покрытием покровные листы на стерильной тарелке и аспирируйте остатки воды. Дайте покровным стеклам высохнуть в колпаке для культуры тканей в течение 1 часа или до тех пор, пока не останутся капли воды. После высыхания закройте посуду парапленкой и установите при температуре 4 °C.
- Поместите по одному покровному стеклу, покрытому поли-L-лизином, в каждую лунку 24-луночного планшета. Использование полилизиновых покровных стекол имеет решающее значение для предотвращения отслоения клеток от покровных стеблей на этапе предварительной экстракции.
- Трипсинизируйте клетки OVCAR3, как только они достигнут 70%-80% конфлюенции.
- Чтобы трипсинизировать 10-сантиметровую чашку для культивирования, которая на 70%-80% сливается, отсадите среду из тарелки и промойте 5-7 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
- Отсадите PBS, добавьте 1 мл 0,25% трипсина и поместите чашку в инкубатор с температурой 37 °C на 8-10 минут или до тех пор, пока клетки не оторвутся со дна тарелки.
- Соберите клетки с 5-10 мл среды и добавьте в коническую пробирку.
- Подсчитайте клетки вручную с помощью гемоцитометра с помощью стандартных процедур.
- Сделайте разведение на 25 000 клеток/мл и добавьте 1 мл клеток на поли-L-лизиновых покровных стеклах, помещенных в лунки 24-луночных планшетов. Для любой другой клеточной линии определите число таким образом, чтобы клетки сливались примерно на 70-80% после трех удвоений популяции.
- Выращивают клетки в культуральной среде в стандартных условиях.
2. Пульсирующие ячейки с IdU
- Чтобы клетки правильно распределились по покровным листам, достаточно одного удвоения популяции. После одного удвоения популяции ввели в клетки 10 мкМ 5-йодо-2'-дезоксиуридин (IdU) (см. Таблицу материалов о том, как восстановить IdU) для двух последующих удвоений популяции.
заметка: Мы пробовали различные аналоги тимидина, включая бромоксиуридин (BrdU), 5-хлор-2'-дезоксиуридин (CIdU) и IdU. Среди трех аналогов IdU обеспечивает наилучшее соотношение сигнал/шум. Сравнительные изображения импульсных клеток с тремя различными аналогами показаны на рисунке 2. Мы рекомендуем использовать два отрицательных контроля: (i) импульсный образец без IdU и (ii) контроль без первичных антител. Если необходимо оценить образование одноцепочных ДНК в связи с данным лечением, мы рекомендуем добавить препарат после первого раунда удвоения IdU.
- После пульсации с помощью IdU в течение двух удвоений популяции соберите клетки для визуализации.
- Замените среду на ледяную 0,5% PBSTx (PBS + 0,5% Triton X-100) на лед на 5 минут. Этот этап предварительной экстракции помогает высвободить цитоплазматические и нехроматин-связанные белки, оставляя хроматин-связанные белки нетронутыми. Некоторые клеточные линии могут легко отслаиваться во время предварительной экстракции. В таком сценарии можно использовать 0,5% буфер CSK (10 мМ ТРУБКИ (pH 6,8), 100 мМ хлорида натрия (NaCl), 300 мМ сахарозы, 3 мМ хлорида магния (MgCl2), 1 мМ этиленгликоля тетрауксусной кислоты (EGTA) и 0,5% Triton X-100).
3. Фиксация
- Отсадите PBSTx и инкубируйте в течение 15 минут с 3% параформальдегидом (PFA) (Таблица материалов) при комнатной температуре, после чего следует три-четыре промывки 1x PBS. Неподвижные элементы могут поддерживаться при температуре 4 °C до дальнейших шагов.
ВНИМАНИЕ: PFA является высокотоксичным и канцерогеном. Избегайте попадания на кожу, в глаза и на слизистые оболочки. Выполните все действия с PFA в вытяжном шкафу и правильно утилизируйте материалы.
4. Пермеабилизация и блокировка
- После фиксации проникните клетки с помощью 0,5% PBSTx на лед в течение 5 мин. Используйте достаточный объем, чтобы покрыть весь покровный лист (обычно от 500 мкл до 1 мл).
- Промойте клетки три-четыре раза 0,2% PBST (1X PBS + 0,2% Tween-20) при комнатной температуре. Для промывки каждой лунки достаточно одного мл PBST. Выполняйте промывки подряд без инкубации.
- Аспирируйте PBST и блокируйте образцы с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина, BSA (Table of Materials), изготовленного в 1x PBS (блокирующий буфер) в течение 30 минут при комнатной температуре.
5. Иммуноокрашивание антителом IdU
- Для иммуноокрашивания подготовьте увлажненную камеру (намочите бумажным полотенцем на плоскодонной посуде Tupperware). Накройте крышку 24-луночного планшета парапленкой, поместите во увлажненную камеру, а на крышку тарелки положите покровные стекла.
- Приготовьте первичное мышиное антитело против BrdU (Таблица материалов), разбавив его в соотношении 1:200 в блокирующем буфере с шага 4.2. Ранее было показано, что антитело против BrdU обнаруживает IdU.
- Добавьте 60 мкл разведения антител IdU на верхнюю часть покровных стекол. Инкубируйте покровные стекла в течение 1 часа при 37 °C.
- В качестве альтернативы можно использовать меньшее количество раствора антитела, если покровные стекла перевернуть на каплю (20-25 мкл) разведения антител 1:200, нанесенную пипеткой на парапленку. Это также снижает вероятность высыхания раствора во время инкубации.
- После 1 ч инкубации аспирируйте первичное антитело. Верните покровные стекла обратно в 24-луночную пластину и промойте их четыре раза с 0,2% PBST.
- Для вторичного антитела используют ту же увлажненную камеру, описанную в шаге 5.1. Разведите антимышиное конъюгированное вторичное антитело (Таблица материалов) в блокирующем буфере (1:200). Добавьте 60 мкл вторичного антитела в покровные стекла и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 1 ч. Это вторичное антитело является светочувствительным.
- Аспирация вторичного антитела. Верните покровные стекла обратно на 24-луночный планшет и промойте четыре раза с 0,2% PBST.
- Наклейте этикетки на предметные стекла микроскопа и закрепите покровные стекла на предметных стеклах с помощью монтажного носителя 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (Таблица материалов). Храните предметные стекла в темноте при комнатной температуре в течение 24 часов. Инкубация в течение 24 часов рекомендуется, если монтажная среда нуждается в отверждении или закаливании.
заметка: Затем предметные стекла можно хранить при температуре 4 °C перед получением изображения на флуоресцентном микроскопе. Репрезентативное изображение показано на рисунке 3.
