Технология Snap Chip для мультиплексного сэндвич-иммуноанализа без перекрестной реактивности

Аннотация

Источник: Li, H. et al., Snap Chip для мультиплексных иммуноферментных анализов без перекрестной реактивности и без споттера.J. Vis. Exp. (2017)

В видео демонстрируется реализация технологии snap chip для мультиплексного иммуноферментного анализа без перекрестной реактивности. Простое действие защелкивания двух предметных стекол микрочипов, каждый из которых содержит разные реагенты, обеспечивает перенос реагентов без перекрестного загрязнения и помогает обнаружить несколько белков с помощью сэндвич-иммуноанализа.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Производство и хранение защелкивающихся чипов

1. Метод одиночной передачи (Рисунок 1a)
   1. Пятнистые растворы cAb, содержащие 400 мкг/мл антител и 20% глицерина в фосфатно-солевом буфере (PBS), на предметном стекле из нитроцеллюлозы (или функционализированного стекла) с помощью струйного микрочип-споттера при относительной влажности 60% (1,2 нл для каждого пятна) с расстоянием между центрами 800 мкм. Убедитесь, что горка закреплена на деке споттера по одному углу (здесь использовался левый нижний угол).
   2. Предметное стекло пятнистого анализа инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч при относительной влажности воздуха 60%.
   3. Зажмите на предметном стекле прокладку модуля предметного стекла с 16 отсеками, чтобы разделить ее на 16 лунок. Промойте предметное стекло три раза, добавив в каждую лунку 80 μL PBS, содержащего 0,1% Tween-20 (PBST), и встряхивайте при 450 об/мин на шейкере, каждый раз 5 минут.
   4. Добавьте в каждую лунку по 80 мкл блокирующих растворов и встряхивайте в течение 1 ч при 450 об/мин.
   5. Снимите прокладку и просушите предметное стекло струей азота.
   6. Закрепите переводной слайд на деке споттера и прижмите нижний левый угол слайда к нижнему левому углу деки споттера. Струйная печать обнаруживает массив выравнивающих меток (раствор микрогранул полистирола) с той же раскладкой, что и для антител захвата (cAb).
   7. Дайте меткам высохнуть. Переверните переводную горку и положите ее обратно на деку споттера, закрепив ее в левом нижнем углу.
   8. Приготовьте пятнистые растворы для обнаружения антител (dAb), содержащие 20 мкг/мл антител, 20% глицерина и 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA).
   9. С помощью камеры корректировщика сфотографируйте отметку юстировки. Внедрите это изображение в программу споттинга в качестве реперного обозначения и получите систему распознавания изображений струйного споттера для определения верхней левой метки. Используйте его координату в качестве первой точки массива dAb. Пятно 8 нл на каплю с расстоянием между центрами 800 мкм.
2. Метод двойного переноса (Рисунок 1b)
   1. Поместите переводной слайд 1 на деку споттера струйной печати в левом нижнем углу. Пятните растворы cAbs, содержащие 400 мкг/мл антител, 20% глицерина и 1% BSA в PBS, на предметное стекло с помощью струйного микрочип-споттера при относительной влажности 60% (0,4 нл на каждое пятно и ~ 200 мкм в диаметре). Межцентровое расстояние составляет 400 мкм.
   2. Защелкните предметное стекло с покрытием из нитроцеллюлозы (или функционализированным стеклом) с помощью защелкивающегося устройства (рис. 2), чтобы перенести капли cAb на предметное стекло.
      1. Поверните все шесть кнопок на боковой стороне защелкивающегося устройства на 90 градусов, чтобы потянуть и зафиксировать все поршни в открытом положении. Вставьте переводную заслонку в держатель затвора в его гнездо обрезанным углом к неподвижному штифту. Поверните первый набор из трех кнопок, чтобы освободить поршни с золотым пого-штифтом, и убедитесь, что слайды прижаты к выравнивающим штифтам.
      2. Вставьте предметное стекло с нитроцеллюлозным покрытием в перевернутый прибор вверх ногами, сидя на 4 штифтах. Поверните второй набор из трех кнопок, чтобы освободить плунжеры с серебряным штифтом, и убедитесь, что слайды прижаты к выравнивающим штифтам.
      3. Закройте защелкивающийся аппарат, поместив верхнюю оболочку на держатель слайда, используя выравнивающие стойки и отверстия для точного позиционирования.
      4. Вставьте закрытое защелкивающееся устройство в клетку и полностью нажмите на закупорочный язычок, чтобы поставить микрочипы лицом к лицу с соответствующим давлением. Держите закрытым в течение 1 минуты.
   3. Разделите слайды. Инкубировать предметное стекло при комнатной температуре в течение 1 ч при относительной влажности воздуха 60%. Вымойте, заблокируйте и высушите предметное стекло, как описано в шагах 1.1.3 - 1.1.5.
   4. Поместите еще одну переводную заслонку на деку струйного споттера и нажмите на нижний левый угол. Точечные растворы dAb, содержащие 50 или 100 мкг/мл антител (см. таблицу 1), 20% глицерина и 1% BSA в PBS. Убедитесь, что каждое пятно имеет размер 0,8 нл, а расстояние между центрами между пятнами составляет 400 мкм.
   5. Храните пробу и предметное стекло. Запечатайте предметные стекла для анализа и переноса в герметичный пакет с влагопоглотителем и поместите в морозильную камеру при температуре -20 °C.

2. Мультиплексные иммунологические анализы с помощью чипов

1. Достаньте предметное стекло из морозильной камеры. Оставьте пакет закрытым на 30 минут, пока предметное стекло не нагреется до комнатной температуры.
2. Приготовьте 7-точечные серийные разбавленные растворы путем спайкового введения белков в PBS, содержащих 0,05% Tween-20.
   заметка: Здесь используется 5-кратный коэффициент разбавления. Начальные концентрации для каждого белка приведены в таблице 1.
3. При необходимости приготовьте образцы растворов. Например, разведите человеческую сыворотку в 4 раза в PBST-буфере.
4. Зажмите прокладку с 16 отделениями на предметном стекле
.
5. Заполните одну колонку из 8 лунок 7 растворами для разведения белка и безбелковым буферным раствором PBST с помощью пипетирования. Дозируйте растворы проб в другие 8 лунок на том же предметном стекле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В каждую лунку можно поместить растворы объемом 80 μL. При необходимости можно использовать больше предметных стекол для измерения дополнительных образцов.
6. Инкубируйте образцы в шейкере при 450 об/мин в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C. Трижды промойте предметное стекло PBST на шейкере при 450 об/мин, каждый раз по 5 минут. Снимите прокладку и просушите предметное стекло под струей газообразного азота.
7. Достаньте предметное стекло с дАбами из морозильной камеры. Держите пакет закрытым в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем инкубируйте предметное стекло в закрытой камере (например, в пустой коробке для наконечников), содержащей 60% гранулы стабилизации влажности, в течение 20 минут для регидратации.
8. Защелкните предметное стекло с помощью предметного стекла с помощью защелкивающегося устройства (Рисунок 2), чтобы перенести капли dAb. Работу защелкивающегося устройства см. в разделе 1.2.2.
9. Разделите слайды. Предметное стекло инкубировать в закрытой камере, содержащей 60% гранул стабилизации влажности, в течение 1 ч. Зажмите предметное стекло пробирным стеклом с 16 отделениями и промойте предметное стекло 4 раза с помощью PBST на шейкере при 450 об/мин, каждый раз по 5 минут.
10. Пипеткой в каждую лунку внесите 80 мкл растворов, содержащих 2,5 мкг/мл стрептавидина флуорофора в PBS. Выдерживать в течение 20 минут в шейкере при 450 об/мин.
11. Промойте слайдер 3 раза PBST и один раз дистиллированной водой на шейкере при 450 оборотах в минуту. Снимите прокладку и высушите предметное стекло с помощью газообразного азота.

3. Сканирование слайдов и анализ данных

1. Отсканируйте предметное стекло с помощью флуоресцентного микрочипового сканера с использованием лазера с длиной волны 635 нм.
2. Извлеките чистую интенсивность каждого пятна с помощью аналитического программного обеспечения (например, анализатора array-pro
).
3. Рассчитайте предел обнаружения (LOD) каждого белка с помощью статистического программного обеспечения и определите концентрацию белка в образцах.
   заметка: LOD определяется как Y-пересечение стандартной кривой, увеличенное в три раза на стандартное отклонение трех независимых анализов.

Таблица 1. Концентрации белка и LOD в буфере из 50-плексного анализа. LOD для CA 15-3 указан в U/ml (*).

См. См. См. См.

Название белка	Начальная концентрация (нг/мл)	LOD (пг/мл)	Название белка	Начальная концентрация (нг/мл)	LOD (пг/мл)
АНГ2	500	1.3 × 104	Ил-6б	1	2.1 × 102
БДНФ	500	1.0 × 102	Ил-5	50	77
СА 15-3*	1	4,9 × 103	Ил-4	1000	1.5 × 104
КЭА	1000	5.4 × 103	Ил-2	50	76
КСКЛ10/ИП-10	50	1.7 × 102	LEP	200	4,0 × 102
ПКР	200	44	Миг	500	11 × 102
Англ	1000	6.2 × 102	CCL3/MIP-1α	50	3.3
ЭФР	50	1.8 × 102	CCL4/MIP-1β	50	12
EGFR	200	1.9 × 102	ММП-3	500	1.0 × 102
ФАС-Л	500	4.5 × 102	М-КСФ	500	8.2 × 103
ФГФ	500	1.0 × 103	ММП-9	200	3.1 × 102
G-CSF	500	39	CCL2/MCP-1	50	55
GM-CSF	50	3.8	НКАМ-1	500	1.7 × 103
ГРО-α	50	3.0 × 102	β-NGF	200	1.4 × 103
ХЕР2	500	3.5 × 103	НТ-3	200	5.8 × 102
ПДГФ-ВВ	200	73	ОПН	500	1.9 × 103
ИЛ-1β	500	7.9 × 102	ОДП4	200	1.2 ×102
Ил-1ра	200	1.1 × 103	СПАРК	1000	4.6 ×104
Ил-15	50	8.2 × 102	ФНО-α	50	4.4
Ил-12	1	30	ФНО-РИ	50	1.3 × 102
Ил-11	500	1.2 × 103	ФНО-РИИ	50	12
Ил-10	500	6.1 ×102	ФАС/TNFRSF6	200	2.8 ×102
Ил-8	50	6,6	УПА	200	24
Ил-7	2.5	26	uPAR(CD87)	200	76
Ил-6А	1000	84	ВЭГФ	200	6,7 × 102

Результаты

Рисунок 1. Схема методики анализа, сравнивающая (а) одиночный и (б) двойной методы переноса.

Рисунок 2. Схема, показывающая различия между одинарной и двойной передачей.(a) зеркальное отражение реагентов для переноса усиливает угловое смещение между пр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фосфатно-солевая буферная таблетка	Научный центр Фишера	5246501ЕА
Стрептавидин-конъюгированный Cy5	Рокленд	С000-06
Подросток-20	Сигма-Олдрич	стр. 1379
Бычий сывороточный альбумин	Джексон Иммуноисследовательские лаборатории, Инк	001-000-162 (Английский
глицерин	Сигма-Олдрич	Г5516
Решение для блокировки: StabilGuard Choice Microchip Stabilizer без BSA	СурМодикс, Инк	ИК02
Предметные стекла с нитроцеллюлозным покрытием	Грейс Био-Лаборатории, Инк	305116
Предметные стекла с покрытием Aminosilane	Schott Северная Америка	1064875
Защелкивающееся устройство	Parallex BioAssays Inc.	ПБА-СД01
Струйный микроматричный споттер	ГеСиМ	Наноплоттер 2.0
Прокладка модуля скольжения	Грейс Био-Лаборатории, Инк	204862
Шарики для стабилизации влажности	Parallex BioAssays Inc.	ПБА-ХУ60
Программное обеспечение Array-Pro Analyzer	Медиа Кибернетика	Версия 4.5
Флуоресцентный микрочиповый сканер	Agilent	Сканер микрочипов SureScan
Программное обеспечение для биостатистики	Программное обеспечение GraphPad	ГрафПад Призма 6
Антитела к захвату эндоглина	Системы НИОКР	MAB10972
Белок эндоглин	Системы НИОКР	1097-RU
Антитела для обнаружения эндоглина	Системы НИОКР	BAF1097
Ил-6а (см. таблицу 1)	Системы НИОКР
Ил-6б (см. таблицу 1)	Инвитроген

)