Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Окрашивание первым антителом
- Депарафин и регидрат с фиксированным формалином парафином (FFPE) по 5 минут отводится на каждый из следующих этапов: ксилол или эквивалентные реагенты 3x, 100% этанол 2x, 95% этанол 1x, 70% этанол 1x, 50% этанол 1x и дистиллированная вода 2x.
заметка: Предметные стекла должны оставаться влажными, начиная с этого этапа регидратации до монтажа на последнем этапе.
- Для факультативного извлечения антигена поместите предметные стекла в 275 мл кипящего раствора цитрата натрия (10 мМ, pH = 6,0) на 8 мин. Чтобы раствор продолжал кипеть, положите предметные стекла на дно коробки с наконечником для пипетки размером 14 x 9,5 x 9 см3 (Ш x Д x В) с крышкой и разогрейте раствор в микроволновой печи мощностью 700 Вт в микроволновой печи мощностью 700 Вт в течение 8 минут. Затем выньте коробку с наконечником для дозатора из микроволновой печи, откройте крышку и дайте раствору остыть при комнатной температуре (RT) в течение не менее 20 минут.
- Переложите предметные стекла в банку Coplin, содержащую PBST (фосфатно-солевой буфер с 0,1% полисорбата 20/80). Стирать с PBST в течение 5 минут 3 раза. Если вы не переходите сразу к следующему этапу, храните предметные стекла на этом этапе с PBST в банке Coplin при RT в течение нескольких часов или при температуре 4 °C в течение 1-2 дней, если не переходите сразу к следующему этапу.
- Для приготовления блокирующего раствора в качестве блокирующего реагента используют обычную сыворотку вида хозяина вторичного антитела. Также могут быть использованы другие коммерческие блокирующие реагенты. При использовании нормальной сыворотки, использованной в исследовании, представленном в этом исследовании, добавьте 100 мкл нормальной ослиной сыворотки к 4,9 мл PBST. Блокирующий раствор можно хранить при температуре 4 °C до 3 дней.
- Для блокировки стряхните PBST со слайдов и быстро накройте их достаточным раствором для блокировки. Инкубируйте предметные стекла в RT во влажной камере в течение 30 минут.
- Приготовьте первичный раствор антитела (500 мкл для двух слайдов) с помощью блокирующего раствора разбавьте первичное антитело до желаемой концентрации. Раствор следует хранить на льду до использования.
- Для 3β-гидроксистероиддегидрогеназы (3βHSD) добавьте 2 мкл антитела 3βHSD в 498 мкл блокирующего раствора.
- Для тирозингидроксилазы (ТГ) добавьте 0,5 мкл антитела к ТГ в 499 мкл блокирующего раствора.
- Для β-катенина добавьте 1 мкл антитела к β-катенину в 499 мкл блокирующего раствора.
- Для 20α-гидроксистероиддегидрогеназы (20αHSD) добавьте 1 мкл антитела 20αHSD в 499 мкл блокирующего раствора.
- Для цитохрома P450 2F2 (CYP2F2) добавьте 2 мкл антитела CYP2F2 в 498 мкл блокирующего раствора.
- Инкубируйте с первичным антителом, стряхивая блокирующий раствор со предметных стекол, и быстро покрывая их достаточным количеством раствора первичного антитела. Инкубируйте предметные стекла в увлажненной камере в течение ночи при температуре 4 °C. Во время инкубации предметные стекла могут быть накрыты небольшим кусочком парафиновой пленки для предотвращения высыхания.
- На следующее утро вымойте горки с PBST в течение 5 минут 3 раза.
- Приготовьте раствор вторичного антитела (500 мкл для двух слайдов) с использованием блокирующего раствора для разбавления биотинилированного вторичного антитела до желаемой концентрации (например, 1 мкл антитела против мыши или антитела против кролика осла в 499 мкл блокирующего раствора). Раствор следует хранить на льду до использования.
- Инкубируйте со вторым антителом, стряхивая PBST со предметных стекол и быстро покрывая их достаточным количеством раствора вторичного антитела. Инкубировать предметные стекла в увлажненной камере в течение 1 ч при RT.
заметка: Если эндогенный биотин вызывает беспокойство, используйте пероксидазу-конъюгированное вторичное антитело вместо биотинилированного вторичного антитела. Перейдите к шагу 1.14 при использовании пероксидазного конъюгированного вторичного антитела на шаге 1.10.
- Вымойте слайды с PBST в течение 5 минут 3 раза.
- Приготовьте раствор стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена (SA-HRP) (500 мкл для двух слайдов), добавив 0,5 мкл SA-HRP в 499 мкл PBS. Конечная концентрация составляет 1 мкг/мл.
- Инкубируйте с помощью раствора SA-HRP. Стряхните PBST со слайдов и быстро накройте слайды достаточным раствором SA-HRP. Инкубируйте предметные стекла в увлажненной камере в течение 0,5 ч при RT.
- Вымойте слайды с PBST в течение 5 минут 3 раза.
- Приготовьте раствор фторофора-тирамида путем разбавления фторофора-тирамида буфером для его разбавления в соответствии с инструкциями производителя (например, 5 мкл фторофор-тирамида на 496 мкл разбавляющего буфера).
- Проявку сигнала проводят с помощью фторофор-тирамида, стряхивая PBST со слайдов и быстро покрывая слайды достаточным количеством раствора фторофор-тирамида. Инкубировать во влажной камере в течение 1 минуты при RT. Время инкубации может быть скорректировано для получения желаемой интенсивности флуоресценции. Остановите реакцию, переложив предметные стекла в банку Coplin, содержащую PBST. Вымыть предметные стекла с PBST в течение 3 мин 2 раза.
- На этом этапе сигналы могут быть быстро проверены под флуоресцентным микроскопом для подтверждения результата. Если покровные стекла не используются, нанесите каплю глицерина:PBS (1:1) на каждую секцию, чтобы образцы оставались влажными. Вымыть предметные стекла с PBST в течение 3 мин 2 раза. Предметные стекла могут храниться в PBST при температуре 4 °C в течение нескольких дней, прежде чем перейти к следующему этапу.
2. Удалите первое антитело
- Поместите предметные стекла в 275 мл кипящего раствора цитрата натрия (10 мМ, pH = 6,0) не менее чем на 8 мин. Поддерживайте кипение раствора, положив предметные стекла на дно коробки с наконечником для дозатора размером 14 x 9,5 x 9 см3 (Ш x Д x В) с крышкой и разогрев раствор на 70% мощности в микроволновой печи мощностью 700 Вт в течение 8 минут. Если предпочтительно более длительное время отпарки, может потребоваться доливать буфер с помощью кипящего раствора цитрата натрия, чтобы предметные стекла постоянно находились в буферном растворе. Извлеките коробку с наконечником для дозатора из микроволновой печи, откройте крышку и дайте раствору остыть при температурной температуре в течение не менее 20 минут.
- Переложите предметные стекла в банку Coplin, содержащую PBST. Стирать с PBST в течение 5 минут 3 раза. Если следующий шаг не выполнен немедленно, храните предметные стекла в банке Coplin с PBST при температуре RT в течение нескольких часов или при температуре 4 °C в течение 1-2 дней.
3. Окрашивание вторым антителом
- Начните с шага блокировки и следуйте тем же процедурам, что и с шага 1.5 по шаг 1.14. На этапах развития сигнала (шаг 1.15 и шаг 1.16) используйте флуорофор-тирамид в другом спектре флуоресценции.
заметка: С помощью этого метода предметные стекла можно снимать несколько раз, чтобы обеспечить мультиплексное окрашивание. Последнее антитело не требует фторофор-тирамида в качестве репортера. Вторичное антитело, конъюгированное с флуорофором, может быть использовано для демонстрации сигналов от последнего первичного антитела.
- Инкубируйте предметные стекла с 2 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) или раствором Хёхста в течение 1 минуты при RT, если требуется противоядерное окрашивание. Затем промойте горки PBST в течение 3 мин 2 раза.
