Мультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация для анализа субпопуляций Т-клеток, устойчивых к иммунотерапии

Аннотация

Источник: Granier, C., et al. Мультиплексный иммунофлуоресцентный анализ и количественная оценка внутриопухолевых PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8⁺ Т-клеток. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует метод флуоресцентной мультиспектральной визуализации in-situ для анализа различных субпопуляций инфильтрирующих Т-клеток в опухолевой ткани. Криосекцию ткани почечно-клеточной карциномы обрабатывают антителами к мечению CD8+ Т-клеток, которые экспрессируют специфические ингибирующие рецепторы и проявляют фенотип, устойчивый к иммунотерапии. Размеченный срез визуализируется с помощью мультиспектрального микроскопа для идентификации различных субпопуляций CD8+ Т-клеток.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB

1. Иммунофлуоресцентное окрашивание инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILs) in situ

1. Процедурные руководящие принципы
   1. Выполняйте все экспериментальные действия при комнатной температуре.
   2. На всех этапах выполняйте разведение с помощью Трис-буферного физиологического раствора (TBS; см. Таблицу материалов).
   3. Выполняйте промывку в TBS на всех этапах, кроме первичной инкубации антител. Для последнего используйте Tris Buffer Salt Tween20 (TBST, с....

Результаты

Рисунок 1: Иммуноокрашивание CD8-PD-1-Tim-3 на ткани, залитой парафином в миндалинах. Для тройного иммуноокрашивания были выбраны срезы тканей, залитые парафином, вместо криоконсервированных срезов. После депарафинизации и регидратации был применен тот же протокол окрашивания, который ранее был разработан для криоконсервированных участков. CD8+ Т-клетки расположены за пределами зародышевого центра, а.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Vectra 3 Автоматизированная количественная визуализация патологии	Перкин Элмер	CLS142338
Анализ клеток inForm 2.1.	Перкин Элмер	CLS135781
Программное обеспечение R	https://www.r-project.org
Разграничительная ручка Dakopen	Дако	С2002
Трис Буфер Физиологический раствор TBS таблетки	Такара, Био Инк.	TAKT9141Z	pH7.6 100 таблетки
Трис Буферный Солевой Твин 20 ТБС(+Tween20)	Такара, Био Инк.	TAKT9142Z	pH 7,6 100 таблеток
Система блокировки биотина	Дако	Х0590	Авидин 0,1% и Биотин 0,01%
Обычная ослиная сыворотка	Иммуноисследования Джексона	017-000-001	Об./об. концентрация 5% об./об.
Флюорощиток с DAPI	Сигма-Олдрич	Ф6057	Концентрация 1,5 мкг/мл
Покровная крышка из ниттельного стекла	Книттель Глезер,	100039	24x60 мм 100 накладок
Кролик анти-CD8 Клон P17-V	Новус	НБП1-79055	использование при 4 мкг/мл
Мышь анти-PD-1 Клон NAT	АБКАМ	АБ52587	использовать при концентрации 2 мкг/мл
Козий анти-Тим-3	НИОКР	АФ2365	использовать при концентрации 3 мкг/мл
Кролик анти-PD-L1 Клон SP142	Рош	7309457001	использовать при концентрации 1 мкг/мл
Мышь AF647 с меченой сковородой - Keratin Clone C11	Сигнализация сотовой связи	No 4528	использование при концентрации 0,5 мкг/мл
Козья античеловеческая гал9	НИОКР	АФ2045	использовать при концентрации 0,3 мкг/мл
Голубой 5 конъюгированный ослик против кролика	Иммуноисследования Джексона	711-175-152	использовать при концентрации 5 мкг/мл
Биотинилированный F(ab'2) ослиный антимышиный IgG	Иммуноисследования Джексона	715-066-150 (Английский	использовать при концентрации 3 мкг/мл
Alexa Fluor488 конъюгированный ослик антикозий IgG	АБКАМ	АБ150133	использовать при концентрации 5 мкг/мл
Cy3 меченый стрептавидин	Амершам	PA43001	использовать при концентрации 3 мкг/мл
Мышь с отрицательным контролем IgG1	Дако	Х0931	использовать при концентрации 2 мкг/мл
IgG из сыворотки крови коз	Сигма-Олдрич	И5256	использовать при концентрации 3 мкг/мл
IgG из сыворотки крови кроликов	Сигма-Олдрич	И5006	использование при 4 мкг/мл

)