Мультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация для анализа субпопуляций Т-клеток, устойчивых к иммунотерапии

Аннотация

Источник: Granier, C., et al. Мультиплексный иммунофлуоресцентный анализ и количественная оценка внутриопухолевых PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8⁺ Т-клеток. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует метод флуоресцентной мультиспектральной визуализации in-situ для анализа различных субпопуляций инфильтрирующих Т-клеток в опухолевой ткани. Криосекцию ткани почечно-клеточной карциномы обрабатывают антителами к мечению CD8+ Т-клеток, которые экспрессируют специфические ингибирующие рецепторы и проявляют фенотип, устойчивый к иммунотерапии. Размеченный срез визуализируется с помощью мультиспектрального микроскопа для идентификации различных субпопуляций CD8+ Т-клеток.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB

1. Иммунофлуоресцентное окрашивание инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILs) in situ

1. Процедурные руководящие принципы
   1. Выполняйте все экспериментальные действия при комнатной температуре.
   2. На всех этапах выполняйте разведение с помощью Трис-буферного физиологического раствора (TBS; см. Таблицу материалов).
   3. Выполняйте промывку в TBS на всех этапах, кроме первичной инкубации антител. Для последнего используйте Tris Buffer Salt Tween20 (TBST, см. Таблицу материалов). Состав и восстановление буфера см. в таблице 1.
   4. Используйте влажностную камеру для инкубации антител и баночку для окрашивания для мытья.
   5. Не допускайте пересыхания участка во время процедуры.
2. предварительная обработка
   1. Разморозьте предметное стекло, содержащее образец ткани, и тщательно высушите предметное стекло вокруг образца бумажным полотенцем. Разграничьте область реакции, содержащую ткань, с помощью гидрофобной барьерной ручки (см. Таблицу материалов). Сушите в течение 2 минут.
   2. Зафиксируйте образцы в 100% ацетоне на 5 минут, высушите в течение 2 минут и промойте TBS в течение 10 минут.
3. Насыщение и блокада
   1. Предварительно обработайте предметные стекла в течение 10 минут 3 каплями авидина 0,1%, постукивайте и/или пролистывайте предметное стекло, чтобы распределить авидин и удалить пузырьки воздуха, а затем обрабатывайте в течение 10 минут 3 каплями биотина 0,01% (см. Таблицу материалов), коснитесь и/или пролистайте. Умывайтесь с TBS.
   2. Проведите блокаду Fc-рецепторов. Внесите 100 мкл 5% объема/объема нормальной сыворотки, разведенной при TBS. Используйте сыворотку от того же вида-хозяина, что и меченое вторичное или третичное антитело (см. Таблицу материалов); Здесь использовалась ослиная сыворотка. Выдерживать в течение 30 минут.
   3. Во время инкубации кратковременно вращают анти-CD8, программируют белок клеточной смерти 1 (PD-1), а также антитела к Т-клеточному иммуноглобулину и муцинсодержащему белку-3 (Tim-3) (Таблица материалов). Приготовьте смесь первичных антител при ТБС, как описано в таблице 2.
4. Иммуноокрашивание на CD8, PD-1 и Tim-3
   1. Приготовьте первичную смесь антител. В Таблице материалов и Таблице 2 указаны используемые антитела (анти-CD8, PD-1, Tim-3 и соответствующие им вторичные антитела) и их концентрации.
   2. Нажмите и/или проведите по оставшейся сыворотке ослика (добавлено на шаге 1.3.2). Инкубируйте предметные стекла со 100 мкл смеси немеченых первичных антител в течение 1 ч во увлажненной камере.
   3. Во время инкубации кратковременно вращайте антикроличьи антитела Cyanine 5, Alexa Fluor 488-anti-goat и биотинилированные антитела против мышей и приготовьте смесь вторичных антител, как описано в таблице 2.
   4. Промойте слайды в TBST в течение 5 мин. Высушите слайды.
   5. Инкубируйте предметные стекла со 100 мкл вторичных антител в течение 30 мин во увлажненной камере.
   6. Приготовьте смесь третичных антител, содержащих цианин 3-стрептавидин, как описано в таблице 2.
   7. Промойте слайды в TBS в течение 10 мин. Высушите слайды.
   8. Инкубируйте предметные стекла со 100 мкл третичной смеси антител в течение 30 мин.
   9. Промойте слайды в TBS в течение 10 мин. Высушите слайды.
5. Монтаж ячеек
   1. Установите предметные стекла в 4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид (DAPI), содержащий монтажную среду (1,5 мкг/мл DAPI) с покровным стеклом, подходящим для флуоресцентной микроскопии (см. Таблицу материалов).
      заметка: В качестве отрицательного контроля для каждого эксперимента использовали одно предметное стекло с антителами, соответствующими изотипу, в той же концентрации, что и соответствующие антитела. Для этого окрашивания мы использовали мышиный IgG1, кролик IgG и козьи IgG-отрицательные контрольные антитела (см. Таблицу материалов). В качестве положительного контроля для каждого эксперимента мы использовали гиперплазменную миндалину человека, которая, как известно, положительна на тестируемые маркеры. Типичное окрашивание описано в результатах (Рисунок 1). Моноокрашивание CD8, PD-1 и Tim-3 следует проводить по отдельности (одно окрашивание на предметное стекло) с одинаковой предварительной обработкой и без DAPI. Также следует провести предметное стекло в тех же экспериментальных условиях без каких-либо антител и только с монтажной средой DAPI. Слайд должен быть изображен в идентичных экспериментальных условиях без каких-либо антител и без DAPI.

2. Флуоресцентный анализ и автоматический подсчет клеток

1. Получение изображений с помощью автоматизированного микроскопа
   1. Создайте протокол.
      1. Включите программное обеспечение автоматического микроскопа и флуоресцентный осветитель.
      2. В строке меню нажмите «Файл», «Создать протокол», выберите «DAPI», «FITC» и «TRITC».
      3. Выберите имя, например, «CD8-PD-1-Tim-3», нажмите «Далее» и «Сохранить».
      4. Вручную поместите слайд на рабочую область.
      5. В строке меню нажмите «Настройка» и «Настройки». Нажмите «Установить дом Z» в новом окне.
      6. Отрегулируйте время экспозиции с помощью положительного контрольного предметного стекла, т.е. CD8, PD-1 и Tim-3, трижды окрашенных образцом DAPI.
      7. В панели управления нажмите «установить экспозицию».
      8. Регулируйте время экспозиции для каждого фильтра до тех пор, пока не будет получен достаточный, но не насыщающий сигнал.
      9. Для создания монохромного изображения выполните следующие действия.
      10. Выберите «Съемка» и в разделе «Автофокус» выберите фильтр DAPI.
      11. В «ограничении области сканирования» переместите объектив вверх в верхний левый угол предметного стекла. Нажмите «Отметить». Проделайте то же самое для правого нижнего угла.
          заметка: Этот шаг ограничивает область маломощной визуализации (LP-визуализации) в 4-кратном увеличении; Обязательно поставьте отметку так, чтобы она окружила все образцы серии.
      12. Для создания изображений с высокой мощностью (HP) выполните следующие действия:
      13. В разделе «Автофокус» выберите «DAPI».
      14. В поле "Acquisition" выберите "DAPI," "FITC," "Cy3" и "Cy5". Нажмите «ОК». Нажмите «Файл» и «Сохранить протокол» в строке меню.
   2. Отсканируйте слайды.
      1. Загрузите протокол, нажав «Файл» и «Загрузить протокол» в строке меню. Нажмите «Начать».
      2. Введите «Lab ID» (папка для хранения изображений). Введите идентификатор слайда, чтобы идентифицировать слайд. Нажмите «Далее».
      3. Нажмите "Монохромное изображение" (чтобы отсканировать весь слайд при ярком свете поля и получить последовательные изображения с помощью 4-кратного объектива).
         заметка: В результате создается обзор слайда в оттенках серого.
      4. Нажмите «Найти образец». Выберите область ткани для сканирования с низким разрешением (4x): удерживайте клавишу «Ctrl» и нажмите на поле с помощью курсора, чтобы выбрать или отменить выбор полей (Рисунок 2A).
      5. Нажмите "LP Imaging" (4x image) для получения флуоресцентного изображения Red Blue Green для каждого поля.
      6. Для выбора полей HP удерживайте нажатой клавишу «Ctrl» и щелкните по полю с помощью курсора, чтобы выбрать или отменить выбор полей, соответствующих области ткани, которая будет сканироваться с высоким разрешением (20x). Выберите 5 полей (Рисунок 2B).
      7. Нажмите «HP Imaging» (20-кратное изображение) для получения мультиспектрального изображения каждого поля (рис. 2C).
      8. Нажмите «Хранилище данных», чтобы сохранить изображения в выбранной ранее папке в LabID.
         заметка: Процесс обобщен и проиллюстрирован на рисунке 2. Для каждого шага (обнаружение ткани, выбор поля) пользователь может добавить и обучить алгоритм для полностью автоматизированного процесса сканирования.

Таблица 1: Состав буфера TBS и TBST. TBS используется для смесей антител и разведений. Для промываний все этапы выполняются с TBS, за исключением промываний после первичных антител, где рекомендуется TBST.

См. См.

	ТБС	ТБСТ
Трис-HCl	0,05 млн	0,05 млн
NaCl	0,15 млн	0,15 млн
Подросток 20	- T	0,05%
pH	7,6	7,6
подготовка	1 таблетка в 500 мл H2O

Таблица 2: Подробный состав смеси антител для иммунофлуоресцентного окрашивания CD8-PD-1-Tim-3. Для каждой смеси первичных, вторичных и третичных антител разведение для выполнения в соответствующем объеме TBS дают для общего объема 1 мл. Для одного предметного стекла общий объем реакции составляет 100 мкл для площади ткани 2^см2.

Установка Кабель

Объем первичного антитела			Итоговая V= 1 мл
Кролик анти-CD8	Мышь анти-PD-1	Козий анти-Тим-3	ТБС
1,6 мкл	2 мкл	30 μл	966.4 μл
Объем вторичного антитела
Голубой 5 анти-кролик	Биотинилированный антимышиный	Alexa Fluor 488 против коз	ТБС
3,3 мкл	2 мкл	2,5 мкл	992.2
Объем третичного антитела
	Cy3 меченый стрептавидин		ТБС
	3,3 мкл		996.7

Результаты

Рисунок 1: Иммуноокрашивание CD8-PD-1-Tim-3 на ткани, залитой парафином в миндалинах. Для тройного иммуноокрашивания были выбраны срезы тканей, залитые парафином, вместо криоконсервированных срезов. После депарафинизации и регидратации был применен тот же протокол окрашивания, который ранее был разработан для криоконсервированных участков. CD8+ Т-клетки расположены за пределами зародышевого центра, а...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Vectra 3 Автоматизированная количественная визуализация патологии	Перкин Элмер	CLS142338
Анализ клеток inForm 2.1.	Перкин Элмер	CLS135781
Программное обеспечение R	https://www.r-project.org
Разграничительная ручка Dakopen	Дако	С2002
Трис Буфер Физиологический раствор TBS таблетки	Такара, Био Инк.	TAKT9141Z	pH7.6 100 таблетки
Трис Буферный Солевой Твин 20 ТБС(+Tween20)	Такара, Био Инк.	TAKT9142Z	pH 7,6 100 таблеток
Система блокировки биотина	Дако	Х0590	Авидин 0,1% и Биотин 0,01%
Обычная ослиная сыворотка	Иммуноисследования Джексона	017-000-001	Об./об. концентрация 5% об./об.
Флюорощиток с DAPI	Сигма-Олдрич	Ф6057	Концентрация 1,5 мкг/мл
Покровная крышка из ниттельного стекла	Книттель Глезер,	100039	24x60 мм 100 накладок
Кролик анти-CD8 Клон P17-V	Новус	НБП1-79055	использование при 4 мкг/мл
Мышь анти-PD-1 Клон NAT	АБКАМ	АБ52587	использовать при концентрации 2 мкг/мл
Козий анти-Тим-3	НИОКР	АФ2365	использовать при концентрации 3 мкг/мл
Кролик анти-PD-L1 Клон SP142	Рош	7309457001	использовать при концентрации 1 мкг/мл
Мышь AF647 с меченой сковородой - Keratin Clone C11	Сигнализация сотовой связи	No 4528	использование при концентрации 0,5 мкг/мл
Козья античеловеческая гал9	НИОКР	АФ2045	использовать при концентрации 0,3 мкг/мл
Голубой 5 конъюгированный ослик против кролика	Иммуноисследования Джексона	711-175-152	использовать при концентрации 5 мкг/мл
Биотинилированный F(ab'2) ослиный антимышиный IgG	Иммуноисследования Джексона	715-066-150 (Английский	использовать при концентрации 3 мкг/мл
Alexa Fluor488 конъюгированный ослик антикозий IgG	АБКАМ	АБ150133	использовать при концентрации 5 мкг/мл
Cy3 меченый стрептавидин	Амершам	PA43001	использовать при концентрации 3 мкг/мл
Мышь с отрицательным контролем IgG1	Дако	Х0931	использовать при концентрации 2 мкг/мл
IgG из сыворотки крови коз	Сигма-Олдрич	И5256	использовать при концентрации 3 мкг/мл
IgG из сыворотки крови кроликов	Сигма-Олдрич	И5006	использование при 4 мкг/мл