$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Посев клеток и вирусная инфекция
- За 20–24 ч до инфицирования вирусом семена 5 x 104 клеток фибробластов эмбрионального легкого человека (HEL) или других клеток, подлежащих исследованию, на 4-луночном предметном стекле 11 мм в шахматном порядке в питательной среде (модифицированная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS)). Инкубируйте клетки при 37 °C с 5% углекислым газом (CO2).
заметка: Каждая лунка должна иметь 70-80% слияние клеток на момент заражения.
- На следующий день удалите питательную среду и заинфицируйте клетки вирусами в Medium-199 в диапазоне 4–10 БОЕ/клетку. Инкубируйте инфицированные вирусом клетки в течение 1 ч при 37 °C. Продолжайте встряхивать предметное стекло в течение инкубационного периода.
- После 1 ч инкубации удалите Medium-199 и добавьте питательную среду.
заметка: Препараты, которые препятствуют различным фазам инфекции, могут быть добавлены на этом этапе или до абсорбции вируса.
- Инкубируйте инфицированные вирусом клетки при 37 °C с 5%CO2 в течение различного периода инфекции.
2. Фиксация и пермеабилизация
- В подходящее время заражения быстро промойте инфицированные клетки фосфатно-солевым буфером (PBS) 3 раза и добавьте 200 μL 4% параформальдегида, только что приготовленного в PBS. Инкубируйте клетки с параформальдегидом в течение 8–10 минут при комнатной температуре, чтобы зафиксировать клетки в каждой лунке.
- Асассируйте параформальдегид и промойте лунки 200 мкл PBS в течение 3 раз. Полностью аспирируйте PBS после3-го промывки.
- Добавьте 100 мкл 0,2% неионогенного поверхностно-активного вещества в каждую лунку для проникновения в клетки в течение 5–10 минут.
- Отсадите неионогенное поверхностно-активное вещество и промойте лунки 200 мкл PBS в течение 3 раз.
3. Иммунофлуоресцентное окрашивание
- Полностью аспирируйте PBS и добавьте 200 μL блокирующего буфера (1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 5% лошадиной сыворотки PBS) в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч или при 4 °C в течение ночи.
- Добавьте экспериментально определенную концентрацию первичного антитела против инфицированного клеточного белка 0 (поликлонального антитела кролика против ICP0) в блокирующий буфер и инкубируйте первичное антитело при комнатной температуре в течение 2 ч или при 4 °С в течение ночи.
- Промыть блокирующим буфером 3 раза с 10 минутной инкубацией. Добавьте Alexa 594-конъюгированное козье вторичное антитело против кролика (1:400, разведенное в блокирующем буфере) и инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем промойте предметные стекла 3 раза с блокирующим буфером с интервалом в 10 минут.
- Наконец, промойте предметное стекло один раз PBS, чтобы удалить остатки BSA и лошадиной сыворотки.
- Добавьте одну каплю антивыцветающего монтажного материала с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для крепления слайда и запечатайте его покровным стеклом с прозрачным лаком для ногтей.
4. Конфокальная визуализация
- С помощью конфокального микроскопа установите длину волны на 590–650 нм для Alexa 594 и 410–520 нм для DAPI. Выберите формат изображения 1024 x 1024 и среднее значение строки 8 для получения изображений с высоким разрешением.
- Проанализируйте каждую лунку на 4-луночном предметном стекле под конфокальным микроскопом. Получите репрезентативные изображения клеток с целью 100X, как показано на рисунках 1 и 2.
- Для подсчета большого количества ячеек делайте снимки последовательных полей с объективом 40X.
заметка: Требуется 5–10 изображений, чтобы накопить более 200 инфицированных клеток из каждой временной точки каждой инфекции.
- В каждом эксперименте делайте снимки с постоянными конфокальными параметрами для всех образцов, которые необходимо сравнивать.
5. Анализ ядерного и цитоплазматического распределения
- Откройте проект с помощью конфокального прикладного программного обеспечения. Выберите изображение, из которого клетки должны быть сведены в таблицу для ядерного и цитоплазматического распределения ICP0.
- Нажмите на вкладку «Количество» в верхнем меню и выберите «Сортировать ROI» в меню инструментов.
- Проведите продольную линию поперек анализируемой клетки, выбрав в верхнем меню пункт "Нарисовать линию".
заметка: Появится гистограмма, показывающая интенсивность флуоресценции вдоль линии как для ICP0, так и для DAPI. На гистограмме синяя линия представляет пиксели DAPI и отмечает границу ядра, тогда как красная линия представляет пиксели ICP0.
- На основе фонового окрашивания установите постоянный порог интенсивности ICP0 для анализа субклеточного распределения ICP0 в каждом эксперименте.
- Как показано на рисунке 2, если красный сигнал в среднем ниже порогового значения в ядерной области, но выше порога за синей границей, классифицируйте красный сигнал как преимущественно расположенный в цитоплазме.
- Если красный сигнал находится выше порогового значения по всему ядру и за границей синего сигнала, сгруппируйте красный сигнал как ядро плюс цитоплазматическая локализация.
- Если красный сигнал находится выше порога в ядре, но в среднем находится ниже него за пределами синего сигнала, то сгруппируйте красный сигнал как ядерную локализацию.
- Сведите в таблицу более 200 инфицированных клеток из каждого образца в разное время заражения и нанесите график на гистограмму, чтобы проиллюстрировать движение ICP0 во времени (рис. 3).
