Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Хирургическое иссечение и препарирование тканей
- Усыпить мышь путем внутрибрюшинного введения 1 мл трибромэтанола (приготовленного в соответствии со стандартным протоколом; Таблица материалов).
заметка: При исследованиях легких следует избегать удушьяCO-2, так как это может привести к повреждению легких и изменению особенностей и свойств иммунных клеток легких. Также следует избегать вывиха шейки матки, так как он может привести к механическому повреждению легкого.
- Перенесите мышь в чистое и специально отведенное место для хирургической операции.
- Стабилизируйте мышь тыльной стороной вниз с помощью игл или ленты на четырех концах. Используйте 70% этанол для дезинфекции кожи в области брюшной полости.
- Выполните разрез на коже, от шеи до живота. Аккуратно удалите кожу с грудной клетки.
- Аккуратно удалите грудину и ребра.
- Промойте легкие, вводя 10 мл холодного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) непосредственно в правый желудочек с помощью иглы 18-21 G, пока легкие не станут полностью белыми.
- Осторожно удалите вилочковую железу и сердце, не трогая легкие.
- Аккуратно отделите легкие от окружающих тканей и перенесите их в трубку с буфером для холодного бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Таблица 1).
заметка: Следует приложить усилия для удаления всего прилегающего жира из легких перед дальнейшим приготовлением одноклеточной суспензии, так как это может привести к искажению показаний.
2. Приготовление одноклеточной суспензии
- Перенесите легкие в пустую чашку Петри и измельчите их двумя тонкими скальпелями. Переложите все кусочки измельченного легкого в новую коническую трубку объемом 50 мл. Используйте 5 мл буфера для пищеварения, чтобы промыть тарелку, и добавьте его в 50 мл пробирки, содержащей измельченное легкое (Таблица 1).
заметка: Буфер для дигезирования следует готовить непосредственно перед использованием. Используйте 5 мг/мл коллагеназы. Сочетание 1 или 5 мг коллагеназы с буфером BSA или безбелковым PBS не улучшило результаты (Рисунок 1).
- Закройте крышку пробирки и переваривайте легкое в течение 30 минут на орбитальном шейкере со скоростью 150 об/мин при 37 °C. Остановите реакцию, добавив 10 мл холодного буфера BSA.
- После разложения с помощью иглы 18 г смешайте и растворите кусочки легких. Поместите фильтрующий фильтр 70 μм в верхнюю часть новой конической трубки объемом 50 мл.
заметка: Использование фильтра меньшего размера может привести к потере основных миелоидных популяций.
- Медленно переложите переваренную легочную смесь прямо на ситечко. Используйте резиновую сторону поршня шприца объемом 10 мл, чтобы разбить оставшиеся кусочки легких на фильтре. Обработанный материал промыть на фильтре буфером BSA.
- Центрифугировать одноклеточную суспензию при 350 × г в течение 8 мин при 4 °С.
- Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера для лизиса аммония-хлорида-калия (ACK). Хорошо перемешайте с помощью пипетки объемом 1 мл и выдерживайте в течение 90 с при комнатной температуре.
- Добавьте 10 мл холодного буфера BSA, чтобы остановить реакцию, и центрифугируйте при 350 × г в течение 7 минут при 4 °C. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в буфере для окрашивания, чтобы подсчитать клетки с помощью гемоцитометра.
- Ресуспендирование клеток в концентрации 5 × 106 клеток/мл и использование их для поверхностного окрашивания (см. раздел 2).
заметка: Для этого клетки помещают в 96-луночный планшет с круглым дном, а затем окрашивают антителами и промывают водой. Если планшетная центрифуга недоступна, используйте проточные трубки вместо планшетов. С помощью этого протокола можно получить ~15-20 × 10-6 клеток на легкое от 6-10-недельной мыши C57BL/6 среднего размера.
3. Окрашивание поверхности антител
- Переложите 1 × 106 ячеек по 200 мкл на лунку в 96-луночный планшет. Центрифугируйте планшет при 350 × г в течение 7 мин при 4 °C. Тем временем приготовьте раствор Fc-блока, разбавив антитела против 16/32 (1:100) в окрашивающем буфере (табл. 1).
- Ресуспендировать клетки в 50 мкл предварительно приготовленного раствора Fc-блокирующего раствора (Таблица материалов) и инкубировать в течение 15-20 мин при 4 °C или на льду.
- Добавьте 150 мкл буфера для окрашивания и центрифугируйте планшет при 350 × г в течение 5 мин при 4 °C. Тем временем приготовьте коктейль поверхностных антител путем разбавления поверхностных антител (1:100; Таблица 2) в окрашивании buffer.
ПРИМЕЧАНИЕ: (i) Антитела Anti-16/32 для Fc-блокирования могут быть использованы с поверхностными антителами в той же смеси. (ii) Если используется корректируемый краситель жизнеспособности, добавьте его в поверхностный коктейль антител в разведении 1:1000.
- Ресуспендируют клетки в 50 мкл заранее приготовленного поверхностного коктейля антител и инкубируют в течение 30-40 мин при 4 °C в темноте. Промойте ячейки с буфером для окрашивания дважды.
заметка: Если внутриклеточное окрашивание не требуется, повторно суспендируйте клетки в 200 мкл окрашивающего буфера и приступайте непосредственно к получению данных на проточном цитометре. В качестве альтернативы элементы могут быть зафиксированы и храниться при температуре 4 °C для последующего получения. Мы рекомендуем использовать клетки для проточной цитометрии в течение 24 часов.
4. Фиксация клеток и внутриклеточное окрашивание
- Приготовьте буфер для фиксации/пермеабилизации (Fix/Perm Buffer), смешав три части концентрата фиксации/пермеабилизации и 1 часть разбавителя фиксации/пермеабилизации набора буферов для окрашивания FoxP3/Transcription Factor (Таблица 1).
- Ресуспендируйте клетки в 50 мкл предварительно подготовленного буфера Fix/Perm в лунку 96-луночного планшета, где клетки были покрыты, как описано в разделе 3, и инкубируйте их в течение 20-25 минут при 4 °C в темноте.
- Разбавьте 10-кратный пермеабилизационный буфер в соотношении 1:10 в очищенной деионизированной воде для получения 1-кратного пермеабилизационного буфера.
- Промойте клетки один раз 1x пермеабилизационным буфером. Тем временем приготовьте коктейль внутриклеточных антител путем разведения внутриклеточных антител (1:100) в 1 мл буфера для пермеабилизации.
- Ресуспендируют клетки с использованием 50 мкл предварительно приготовленного поверхностного коктейля антител на клетку 96-луночного планшета и инкубируют в течение 40 мин при 4 °C в темноте.
- Промойте клетки один раз пермеабилизационным буфером и один раз буфером для окрашивания. После окончательной промывки повторно суспендируйте клетки в 200 μл красящего буфера.
заметка: Если проточный цитометр с планшетным ридером недоступен, переведите клетки в пробирки проточной цитометрии.
- Получить минимум 1,5 × 106 клеток на образец на проточном цитометре.
заметка: Для одноцветных и неокрашенных контрольных образцов будет достаточно 0,5-1 × 106 клеток на образец. Рекомендуется титровать отдельные используемые антитела для достижения оптимального окрашивания и снижения затрат. Данный протокол был оптимизирован с использованием Fix/Perm Buffer, подготовленного с использованием набора буферов окрашивания FoxP3. Поскольку CD68 является цитоплазматическим, а не ядерным маркером, могут быть достаточными другие решения для проникновения, такие как низкая концентрация параформальдегида или наборы цитофиксов/цитоперми от различных поставщиков.
Таблица 1: Буферы.
| Буфер BSA | PBS + 0,5% бычий сывороточный альбумин |
| Буфер для разложения | Предварительно подогретый (37 °C) буфер БСА + 5 мг/мл коллагеназа типа 1 + 0,2 мг/мл ДНКазы I |
| Буфер для окрашивания | PBS + 2,5% FBS |
| Фиксация/буфер для перманентной завивки | Три части разбавителя фиксации/пермеабилизации и 1 часть дилюента фиксации/пермеабилизации набора буферного набора Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer |
| Пермеабилизационный буфер | 10-кратный буфер для пермеабилизации из набора буферов для окрашивания Foxp3/Transcription Factor, разбавленных в 10 раз в очищенной деионизированной воде |
Таблица 2: Использование моноклональных антител.
| антиген | клон | Флуорохром | разбавление | Поверхностный/внутриклеточный |
| СД45 | 30-F11 | БТР/CY7 | 1:100 | поверхность |
| Гр-1 | РБ6-8С5 | БВ421 | 1:100 | поверхность |
| СД68 | ФА-11 | ПерКПКy5.5 | 1:100 | внутриклеточный |
| CD11b | М1/70 | ПЭСи7 | 1:100 | поверхность |
| Сиглек Ф | S17007L | ФИТК | 1:100 | поверхность |
| CD11c | Н418 | BV650 или BV510 | 1:100 | поверхность |
| КД64 | Х54-5/7.1 | ПЭ/Ослепление 594 | 1:100 | поверхность |
| MHC-II | М5/114.15.2 | АФ700 | 1:100 | поверхность |
| КД103 | 2.00Э+07 | ПЭ / ФИТК | 1:100 | поверхность |
| Живой/мертвый исправимый набор для удаления мертвых клеток | | FarRed (APC) или Aqua (BV510) | 1:1000 | поверхность |
| CD3 | 17А2 | ПЭ | 1:100 | поверхность |
| В220 | РА3-6Б2 | АФ488 | 1:100 | поверхность |
| НК1.1 | ПК136 | ФИТК | 1:100 | поверхность |
| СД24 | 30-F1 | ПЭ | 1:100 | поверхность |
| МЕРТК | 2В10К42 | ПЭ | 1:100 | поверхность |
| F4/80 | БМ8 | БВ605 | 1:100 | поверхность |
| СХ3CR1 | SA011F11 | ПЭ | 1:100 | поверхность |
| FcBlock (CD16/32) | 93 | | 1:100 | поверхность |
