1. Получение криптококковых клеток
- Нанесите тестируемый организм с помощью петли инокуляции на стерильную агаровую пластину из дрожжевого солодового экстракта (YM).
- Инкубируйте агаровую пластину при температуре 30°C в течение 48 часов.
- С помощью петли инокуляции зачерпните 5 одиночных колоний и суспензируйте их в 5 мл стерильной дистиллированной воды.
- Стандартизируйте клетки с использованием стандарта Макфарланда для получения концентрации клеток от 0,5 × 105 до 2,5 × 105 колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл среды RPMI-1640.
- Диспонируйте клеточную суспензию объемом 100 мкл в лунки микротитровых планшетов, содержащих засеянные макрофаги (см. раздел ниже).
2. Получение макрофагов
- Культивируют мышиную клеточную линию макрофагов, RAW 264.7, на тканевой колбе, содержащую 10 мл среды RPMI-1640 с добавлением стрептомицина 20 мг/мл, 2 мМ L-глутамина, 20 ЕД/мл пенициллина и 10% фетальной бычьей сыворотки.
- Поместите колбу в инкубатор с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C до тех пор, пока не будет достигнуто 80% слияние.
- Аккуратно соскребите ячейки с помощью скребка для клеток.
- Переложите взвешенные элементы в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Используйте синий морилку трипана для определения жизнеспособности клеток.
заметка: Предпочтительна оценка жизнеспособности выше 85%.
- С помощью гемоцитометра отрегулируйте клеточную концентрацию макрофагов до 1 ×10 6 клеток/мл с помощью 10 мл раствора свежей стерильной среды RPMI-1640.
- Диспонируйте 100 мкл суспензии клеток в лунки стерильного 96-луночного микротитровального планшета с плоским дном.
- Инкубируйте планшет в течение ночи в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при температуре 37°C.
заметка: Перед использованием отработанный на ночь фильтрующий материал следует аспирировать и заменить его 100 μл свежего стерильного фильтрующего материала Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640).
3. Приготовление компаунда
- Растворите тестовые фотосенсибилизаторы и примахин (PQ) в дистиллированной воде для приготовления исходного раствора.
- Разбавить состав далее в среде RPMI-1640.
заметка: Итоговое количество дистиллированной воды в среде РПМИ-1640 никогда не должно превышать 1%.
- Дозируйте 100 мкл раствора приготовленного фотосенсибилизатора для четырехкратного увеличения желаемой концентрации в соответствующие лунки, содержащие уже засеянные макрофаги и криптококковые клетки.
4. Реализация фотодинамической обработки (ФДТ)
- Задайте следующие условия эксперимента:
- Ко-культивируемые клетки с 0 мкМ PQ и подверженные воздействию темного света (DL) в течение 2 мин (т.е. необработанные (неRx) клетки)
- Ко-культивируемые клетки с 6 мкМ и подвергающиеся воздействию DL в течение 2 мин (т.е. эффект препарата)
- Ко-культивируемые клетки 15 мкМ PQ и подвергающиеся воздействию DL в течение 2 мин (т.е. эффект препарата)
- Совместное культивирование клеток с 30 мкМ PQ и воздействие DL в течение 2 мин (т.е. эффект препарата)
- Совместное культивирование клеток с 0 мкМ PQ и воздействие ультрафиолета (УФ) в течение 2 мин (УФ-эффект)
- Совместное культивирование клеток с 6 мкМ PQ и воздействие ультрафиолетового света (UVL) в течение 2 минут (т.е. эффект PDT)
- Совместное культивирование клеток с 15 мкМ PQ и воздействие UVL в течение 2 мин (т.е. эффект PDT)
- Ко-культивируемые клетки с 30 мкМ PQ и подвергнутые воздействию UVL в течение 2 мин (т.е. эффект PDT)
заметка: Совместно культивируемым клеткам необходимо дать вступить в реакцию с PQ в течение 30 минут в темноте (если применимо) перед воздействием UVL (если применимо).
заметка: В данной работе мы определили, что PQ имеет поглощение УФ/ВИД на уровне 260 нм, что находится в ультрафиолетовом диапазоне бактерицидной лампы. В связи с последним, в качестве источника света для реализации ФДТ мы использовали бактерицидную ультрафиолетовую лампу С (УФС), установленную в шкафу биологической безопасности класса II. Сообщается, что лампа имеет номинальную мощность 30 Вт. В текущем исследовании клетки содержались на расстоянии примерно 20 см от лампы. Предполагается, что на этом расстоянии лампа имеет выходную мощность излучения 625 мкВт/см2.
5. Подсчет колоний для определения выживаемости криптококковых клеток
- После начала фотодинамической обработки совместно культивируемых клеток, как указано выше, инкубируют планшеты при 37°C в 5 %CO2 в течение 18 ч.
- Через 18 ч отсасывайте надосадочную жидкость.
- Промойте лунки 200 мкл фосфатного буферного раствора (PBS), чтобы смыть неинтернализованные клетки. Повторите этот шаг трижды.
- Добавьте в лунки 300 мкл 0,1% Triton X-100 и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Отсадите содержимое лунок и разложите его по стерильным пластиковым пробиркам объемом 1,5 мл.
- Приготовьте разведение клеток 1 к 10 дистиллированной водой.
заметка: Отрегулируйте разведение таким образом, чтобы можно было восстановить от 30 до 300 колоний на агаровых пластинах.
- Пипеткой нанесите 50 мкл разбавленного вещества на агаровую пластину из дрожжевого солода (YM).
- Используйте метод распростертой пластины, чтобы создать лужайку слияния клеток на поверхности агаровой пластины.
- Инкубируйте планшеты при температуре 30°C в течение 48 часов.
- Подсчитайте колониеобразующие единицы (КОЕ), развившиеся на агаровых пластинах.