Влияние аспирина и ибупрофена на фагоцитарную способность макрофагов

Аннотация

Это видео демонстрирует метод оценки влияния аспирина и ибупрофена в их минимальных ингибирующих концентрациях на фагоцитоз макрофагов с использованием pH-чувствительных флуоресцентных красителей грибковых клеток. Препараты ингибируют циклооксигеназу-2, уменьшая образование простагландинов и усиливая фагоцитоз макрофагов, что наблюдается при флуоресцентных измерениях pH-чувствительного красителя.

Протокол

1. Соображения безопасности

1. Персонал должен использовать средства индивидуальной защиты (СИЗ).
2. Работайте с патогеном и макрофагами в шкафу биологической безопасности класса II.

2. Получение макрофагов

1. Культивируйте мышиную клеточную линию макрофагов, RAW 264.7, в тканевой колбе, содержащей 10 мл среды Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), с добавлением 20 мг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 20 ЕД/мл пенициллина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
2. Поместите колбу в инкубатор с 5% содержанием углекислого газа (CO₂), установленный при температуре 37 °C до тех пор, пока не будет достигнуто 80% слияние.
3. Аккуратно соскребите ячейки с помощью скребка для клеток.
4. Переложите взвешенные элементы в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
5. Используйте трипановый синий краситель для определения жизнеспособности клеток.
   заметка: Предпочтительна оценка жизнеспособности выше 85%.
   С помощью гемоцитометра отрегулируйте клеточную концентрацию макрофагов до 1 × 10⁵ клеток/мл с помощью 10 мл раствора свежей стерильной среды RPMI-1640. Диспенсируйте 100 мкл суспензии клеток в лунки стерильного 96-луночного микротитровального планшета с плоским дном. Инкубируйте планшет в течение ночи в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при температуре 37°C.
   заметка: Отработанный за ночь фильтрующий материал следует аспирировать и заменить 100 μл свежего стерильного фильтрующего материала RPMI-1640 перед использованием.

3. Препарирование криптококковых клеток

1. Нанесите тестируемый организм с помощью петли инокуляции на стерильную агаровую пластину из дрожжевого солодового экстракта (YM).
2. Инкубируйте агаровую пластину при температуре 30°C в течение 48 часов.
3. Используя петлю инокуляции, введите полную петлю клеток в 100 мл бульона дрожжевого азотного основания (YNB) с добавлением 4% глюкозы.
4. Выращивайте клетки (предварительную культуру) в течение ночи, встряхивая при 160 об/мин при 30°C.
5. На следующий день инокулируйте 0,1 мл предкультуры в свежий бульон YNB (основная культура) и дайте клеткам расти до среднеэкспоненциальной фазы (при тех же условиях культивирования).
6. Дважды промойте клетки фосфатным буферным раствором (PBS).
7. Используя гемоцитометр, стандартизируйте клетки до 1 x 10⁵ в PBS.

4. Окрашивание криптококковых клеток фагоцитозным окрашиванием

1. Диспонируйте 999 мкл клеток в пластиковую пробирку объемом 1,5 мл.
2. Добавьте в ту же пробирку 1 мкл красителя pHrodo green zymosan A.
3. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 1 ч, в темноте, при медленном перемешивании вступайте в реакцию с пятном.
4. По окончании инкубационного периода трижды промойте клетки PBS.
5. Диспенсируйте клеточную суспензию объемом 100 мкл в лунки, содержащие затравленные макрофаги.

5. Приготовление лекарств

1. Приготовьте стоковый раствор аспирина, используя 1 мг аспирина в 1000 мл абсолютного этанола до конечной концентрации 1000 мкг/мл.
2. Разбавьте соединение в среде RPMI-1640 до достижения желаемой концентрации препарата.
   заметка: Конечное количество этанола в средах RPMI-1640 никогда не должно превышать 1%. Приготовьте стоковый раствор ибупрофена, используя 1 мг ибупрофена в 1000 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Разбавьте соединение в среде RPMI-1640 до достижения желаемой концентрации препарата.
   заметка: Конечное количество ДМСО в средах RPMI-1640 никогда не должно превышать 1%. Приготовьте 100 мкл раствора приготовленных препаратов в четырехкратном увеличении желаемых концентраций и распределите в соответствующие лунки, содержащие затравленные макрофаги и криптококковые клетки.

6. Влияние химиосенсибилизирующих агентов на фагоцитоз макрофагов

1. Инкубируйте планшеты с совместно культивируемыми клетками в присутствии химиосенсибилизирующих агентов, аспирина или ибупрофена в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при температуре 37°C в течение 2 или 6 часов.
2. В конце инкубационного периода измерьте индуцированную флуоресценцию (например: 492 нм и em: 538 нм).
   заметка: Краситель pHrodo флуоресцирует только в кислой среде, например, внутри фагосомы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
агар	Мерк		Используется для подготовки пластин YM
Дрожжевой экстракт	Мерк		Используется для подготовки пластин YM
Солодовый экстракт	Мерк		Используется для подготовки пластин YM
пептон	Мерк		Используется для подготовки пластин YM
Азотное основание дрожжей (YNB)	Лаборатории Difco		Используется при культивировании криптококковых клеток
глюкоза	Мерк		Используется для подготовки пластин YM
Трипановая синева морилка	Сигма-Олдрич		Перечисление живых и мертвых клеток
Фосфатный буферный раствор (PBS)	Сигма-Олдрич		Промывка и разбавление ячеек
РПМИ-1640 средний	Биохром		Питательные среды для макрофагов
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Биохром		Используется в качестве дополнения к среднему РПМИ-1640
Пенициллин/стрептомицин/L-глутамин	Сигма-Олдрич		Добавлено в средний RPMI-1640
pHrodo зеленый зимозан Краситель А	Технологии Life		Используется для окрашивания внутренних клеток из-за изменения pH
Ацетилсалициловая кислота (Аспирин)	Сигма-Олдрич		Препарат, который подлежит испытанию
Абсолютный этанол	Мерк		Используется для растворения аспирина
ибупрофен	Сигма-Олдрич		Препарат, подлежащий испытанию
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Мерк		Используется для растворения ибупрофена
96-луночные планшеты для микротитрования с плоским дном	Greiner Bio-One		Используется в качестве сосуда, внутри которого происходили реакции
Тканевая колба	Ласек		Используется для культивирования макрофагов
Центрифужная пробирка 15 мл	Ласек		Используется для содержания макрофагов
Скребок ячеек	Ласек		Используется для отделения макрофагов от тканевой колбы
Петля инокуляции	Ласек		Используется для нанесения культуры на агаровую пластину
Гемоцитометр	Мариенфилд		Для определения клеточной концентрации макрофагов
Пластиковые пробирки объемом 1,5 мл	Мерк		Используется в качестве сосуда, внутри которого происходили реакции
Исследовательский спектрофотометр EZ Read 800	Биохром		Для считывания оптической плотности
Восхождение на Флюороскан FL	Термонаучная		Для измерения флуоресценции
Инкубатор CO2	Термофишер		Используется для инкубации макрофагов
Шкаф биологической безопасности класса II	ЭСКО		Чтобы безопасно работать с возбудителями, не причиняя вреда пользователю.