Иммунофлуоресцентный метод для измерения нейтрализации цитомегаловируса человека

Аннотация

Это видео демонстрирует иммунофлуоресцентный анализ, предназначенный для измерения нейтрализации цитомегаловируса человека (HCMV). Вирус-специфические антитела смешиваются с вирусом и инкубируются с клетками фибробластов человека. Антитела нейтрализуют вирус, делая его неспособным заражать клетки-хозяева, в то время как ненейтрализованные вирусы заражают клетки. После инкубации степень нейтрализации определяют путем количественного определения инфицированных вирусом клеток с помощью иммунофлуоресценции.

Протокол

1. Подготовка клеток-мишеней к инфекции

1. Засейте клетки-мишени за день до проведения эксперимента в 96-луночной пластине («тарелке»).
2. Пластина достаточная количество ячеек на лунку, чтобы обеспечить почти сливающийся (~90%) монослой.<бр/> заметка: Это будет зависеть от относительного размера целевого типа ячейки. При использовании фибробластов крайней плоти человека (HFFs) затравите 20 000 клеток/лунку.
3. Как правило, на каждую пробу засевается 21 скважина (7 вниз на 3 в поперечнике), что позволяет анализировать 4 пробы на одну пластину.
4. Засейте еще 12 лунок на пластину (т.е. ряд 8) в качестве контрольных.

2. Приготовление вируса: смеси антител

1. Добавьте 90 мкл среды в сочетании с антителом (и хорошо перемешайте) для получения в два раза больше желаемой начальной концентрации тестируемого антитела в 3 лунки ряда 1 свежего планшета с 96 лунками (планшет для разведения><). заметка: Типичная начальная концентрация антитела должна составлять 20 мкг/мл, но должна быть определена опытным путем.
2. Добавьте по 60 мкл среды в каждую из 18 лунок ниже (т.е. 6 вниз на 3 в поперечнике) в 3 лунки из шага 2.1.
3. Добавьте 60 мкл среды в 12 дополнительных лунок (т.е. ряд 8).
4. Перенесите 30 мкл разведения антител из ряда 1 в соответствующие лунки в ряду 2.
5. Перемешайте содержимое ряда 2, плавно дозируя вверх и вниз 20 раз с помощью многоканальной пипетки.
6. Перенесите 30 мкл разведенного антитела из ряда 2 в ряд 3.
7. Повторяйте этот процесс перемешивания и переноса до тех пор, пока содержимое ряда 7 не будет перемешано.
8. После того, как ряд 7 будет перемешан, слейте 30 μL из лунок в ряду 7.
9. Разведите HCMV в полной среде так, чтобы 50 мкл содержало достаточное количество инфекционных частиц, чтобы вызвать инфекцию MOI=1 при добавлении непосредственно в клетки.
   заметка: HCMV относится к категории патогенов категории биобезопасности 2 (BSL-2). Убедитесь в соблюдении надлежащих процедур безопасности и используйте фильтрующие наконечники для всех сред, подверженных воздействию HCMV.
   заметка: Для этого требуется такое же количество инфекционных частиц, как и клеток/колодцев, которое будет варьироваться в зависимости от типа клеток и тропизма вируса. При использовании HFF, как описано выше, требуемая концентрация вируса составляет 4x10⁵ БОЕ/мл.
   заметка: Убедитесь, что приготовлено достаточное количество разбавленного вируса (например, на 10% больше).
10. Добавьте 60 мкл разбавленного вирусного запаса во все лунки, содержащие разведенные антитела, и в 6 лунок, содержащих только 60 мкл среды.
11. Добавьте только 60 мкл среды в оставшиеся 6 лунок среды, чтобы они служили неинфицированным контролем.
12. Инкубируйте полученный вирус: смеси антител при 37^оС в течение 1 ч.

3. Заражение клеток-мишеней

1. Удалите все носители из целевых ячеек.
2. С помощью многоканальной пипетки перенесите 100 мкл смеси вирус: антител с планшета для разведения на клетки в эквивалентном положении на пластине-мишени.
3. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%_CO2 в течение 24 ч.

4. Фиксация клеток

1. Удалите все носители из ячеек.
   заметка: На этом этапе нет необходимости менять наконечники между лунками.
2. Промойте все лунки 200 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и удалите.
3. Добавьте во все лунки 180 мкл -20 ^оС, 100% этанол.
4. Инкубируйте планшет при -20 ^°C не менее 30 мин.<бр/> заметка: Этот шаг может быть продлен по крайней мере до одного месяца, при условии, что дополнительный этанол добавляется по мере его испарения.
   заметка: С этого момента пластина безопасна в обращении в условиях BSL-1, и с этого момента можно использовать наконечники без фильтра.

5. Обнаружение вирусно инфицированных клеток методом иммунофлюоресценции (ЕСЛИ)

1. Удалите этанол с тарелки.
2. Промойте все лунки 200 μL PBS и удалите.
3. Добавьте 200 μL PBS во все лунки и инкубируйте в течение 5 минут.
   1. Тем временем приготовьте первичное разведение антител в PBS.
   2. На лунку потребуется 100 мкл мышиного моноклонального анти-ИЭ в масштабе 1:2000 (обратите внимание, что разведение относится к специфическому антителу, указанному в материалах).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разведение антител, используемых для ИФ, может потребовать оптимизации, если используется альтернатива.
   3. Вихревую смесь для обеспечения достаточного перемешивания.
4. Удалите PBS из всех лунок и добавьте 100 мкл первичного разведения антител.
5. Выдерживать при комнатной температуре в течение 1 ч.
6. Удалите первичные антитела из всех лунок.
7. Добавьте 200 μL PBS и инкубируйте 5 минут.
   1. Тем временем готовят вторичное антитело и разведение 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в PBS.
   2. На лунку потребуется 100 мкл флуорофор-конъюгированного антимышиного IgG в масштабе 1:2000 и DAPI в концентрации 1:2000
   .
   3. ПРИМЕЧАНИЕ: Разведение вторичных антител, используемых для ПЧ, может потребовать оптимизации, если используется альтернатива.
   4. Вихревую смесь для обеспечения достаточного перемешивания.
8. Удалите PBS из всех лунок и добавьте 100 мкл вторичного антитела/разведения DAPI.
9. Инкубировать в тарелке при комнатной температуре в течение 1 ч, защищенном от света месте.
10. Удалите вторичные антитела/DAPI из всех лунок.
11. Промойте все лунки 200 μL PBS и удалите.
12. Добавьте 200 μL PBS во все лунки и инкубируйте в течение 5 минут.
13. Удалите PBS и добавьте 100 μL PBS во все лунки и храните в защищенном от света месте при температуре 4 ^°C до получения изображения.
    заметка: Пластины могут храниться до одного месяца с минимальными потерями качества сигнала/изображения.

6. Визуализация и подсчет инфицированных клеток

1. Чтобы легко и точно количественно оценить инфекцию, визуализируйте не менее 25% каждой лунки, как в синем (DAPI, ядра), так и во вторичных антителах (белки непосредственного и раннего действия (IE)) каналах.
   заметка: Сигнал, генерируемый иммунофлуоресценцией ИЭ, должен быть похож на сигнал ядерного окрашивания, и для подтверждения этого должны быть проверены изображения.
2. Это можно сделать вручную, но рекомендуется использовать автоматический микроскоп.
   заметка: Увеличение будет зависеть от вашего прибора, но поскольку при визуализации больших структур (ядер) обычно достаточно объективов 4X/10X.
3. После получения изображений обработайте их с помощью выбранной программы анализа программного обеспечения.
   1. Во-первых, идентифицируйте ядра по синему каналу, чтобы рассчитать количество присутствующих клеток.
   2. Только эти области затем должны быть проверены на сигнал в красном канале, так как IE является белком, локализованным в ядерном отношении, чтобы рассчитать количество инфицированных клеток.
4. После того, как количество инфицированных клеток и общее количество клеток подсчитаны, рассчитайте процент заражения в расчете на лунку.
5. Эти значения могут быть скорректированы на фоновые уровни обнаружения путем вычитания среднего процента заражения, наблюдаемого в неинфицированных колодцах, из всех других колодцев.
   заметка: Этот показатель должен быть значительно ниже 1%. Если она больше 1%, то процедура анализа требует оптимизации.
6. Эти значения с коррекцией фона теперь можно строить, опрашивать и анализировать по мере необходимости.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мышиный клон моноклонального антитела к IE 6F8.2	Многородность	MAB8131	Первичное антитело для иммунофлюоресценции
Rabbit Anti-Mouse IgG, конъюгированное антитело Alexa fluor 568	Инвитроген	А-11061	Вторичное антитело к иммунофлюоресценции
Система визуализации WiScan® Hermes с высоким содержанием	Идея Биомедицинская	- T	Высокопроизводительный автоматизированный флуоресцентный микроскоп для количественного определения
Программное обеспечение для анализа изображений Metamorph	Молекулярные приборы	- T	Программное обеспечение для анализа изображений
Контроль изотипа IgG1 человека	Мерк	М5284	Контроль антител для нейтрализации
8F9, антитела к гликопротеину B к HCMV	- T	- T	Нейтрализующие антитела к HCMV
DAPI	Термо Сайентиал	No 62248	Окрашивание клеточных ядер
DMI4000B Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Лейка	- T	Флуоресцентный микроскоп для репрезентативных изображений