Мультиплексное количественное обнаружение бактерий с использованием магнитных микросфер, меченных красителями

Аннотация

Это видео демонстрирует мультиплексное количественное обнаружение бактерий с использованием карбоксилированных магнитных полистирольных микросфер, окрашенных в различные наборы. Процедура включает в себя формирование гранул-бактериальных комплексов, магнитную сепарацию и анализ на основе потока, что позволяет точно и одновременно количественно определять количество нескольких бактерий в одной и той же реакционной скважине.

Протокол

1. Ковалентное связывание захватывающих антител с микросферами MagPlex

Каждое антитело захвата конъюгируется с определенным набором карбоксилированных магнитных микросфер с использованием двухэтапной процедуры, как описано ниже.

ПРИМЕЧАНИЕ: Также доступен комплект для связывания, включающий все реагенты, буферы и материалы, необходимые для соединения микросфер (см. ТАБЛИЦУ МАТЕРИАЛОВ).

1. Восстановите суспензию неотсоединенной микросферной суспензии в соответствии с инструкциями, описанными в информационном листе продукта, прилагаемом к микросферам.
   заметка: Инструкции по ресуспензии будут зависеть от размера и объема ваших стандартных флаконов с микросферами.
2. Переложите 2,5 x 10⁶ исходных микросфер в рекомендованную микроцентрифужную пробирку (см. ТАБЛИЦУ МАТЕРИАЛОВ).
3. Поместите трубку в магнитный сепаратор и дайте отделителю произойти в течение 60 секунд.
Не снимая
4. трубку с магнитного сепаратора, удалите надосадочную жидкость.
   заметка: Следите за тем, чтобы не потревожить микросферы.
5. Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте микросферы в 100 мкл dH₂O с помощью вихря и ультразвука в течение 20 секунд.
6. Повторите шаги 3 и 4.
7. Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте промытые микросферы 80 мкл 0,1 М одноосновного фосфата натрия, pH 6,2 вихревым действием и ультразвуком в течение 20 секунд.
8. Добавьте 10 мкл N-гидроксисульфосукцинимида 50 мг/мл (сульфо-NHS) (разведенного в 0,1 М одноосновного фосфата натрия, pH 6,2) к микросферам и аккуратно перемешайте вихрем.
9. Добавьте 10 мкл 50 мг/мл 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида гидрохлорида (EDC) (разведенного в 0,1 М одноосновного фосфата натрия, pH 6,2) к микросферам и аккуратно перемешайте вихрем.
10. Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре с аккуратным перемешиванием вихрем с 10-минутными интервалами.
11. Поместите трубку в магнитный сепаратор и дайте отделителю произойти в течение 60 секунд.
Не снимая
12. трубку с магнитного сепаратора, удалите надосадочную жидкость.
    заметка: Следите за тем, чтобы не потревожить микросферы.
13. Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте микросферы в 250 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), pH 7,4 с помощью вихря и ультразвука в течение примерно 20 секунд.
14. Поместите трубку в магнитный сепаратор и дайте отделителю произойти в течение 60 секунд.
Не снимая
15. трубку с магнитного сепаратора, удалите надосадочную жидкость.
    заметка: Следите за тем, чтобы не потревожить микросферы.
16. Повторите шаги 13-15 в общей сложности два мытья.
17. Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте активированные и промытые микросферы в 100 мкл PBS, pH 7,4 по вихревому и ультразвуковому воздействию примерно на 20 секунд.
18. Добавьте 12,5 мкг антитела захвата к ресуспендированным микросферам (т.е. 5 мкг/1 миллион микросфер).
    заметка: Моноклональные антитела предпочтительны для захвата, но также могут быть использованы поликлональные антитела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 5 μг белка на 1 миллион бусин обычно хорошо работают, но мы рекомендуем титровать количество для достижения оптимальных результатов анализа.
19. Доведите общий объем до 500 μл с PBS, pH 7,4.
20. Смешайте реакцию сопряжения вихрем.
21. Выдерживать в течение 2 часов с перемешиванием путем вращения при комнатной температуре в темноте.
22. Поместите трубку в магнитный сепаратор и дайте отделителю произойти в течение 60 секунд.
Не снимая
23. трубку с магнитного сепаратора, удалите надосадочную жидкость.
    заметка: Следите за тем, чтобы не потревожить микросферы.
24. Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте связанные микросферы в 1 мл PBS, pH 7,4, содержащем 0,02% Tween-20, 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,05% азида натрия (PBS-TBN) вихревым и ультразвуковым током в течение 20 секунд.
25. Поместите трубку в магнитный сепаратор и дайте отделителю произойти в течение 60 секунд.
Не снимая
26. трубку с магнитного сепаратора, удалите надосадочную жидкость.
    заметка: Следите за тем, чтобы не потревожить микросферы.
27. Повторите шаги 24-26 в общей сложности два мытья.
28. Извлеките трубку из магнитного сепаратора и снова суспендируйте связанные микросферы в 500 мкл PBS-TBN.
    заметка: Определите количество восстановленных микросфер с помощью клеточного счетчика или гемоцитометра.
29. Хранить спаренные микросферы в холодильнике при температуре 2-8°C в темноте.<бр/> заметка: Также доступен протокол для подтверждения эффективности муфты.

2. Мечение антител к обнаружению биотином

1. Антитела к детекции мечали биотином с помощью гексаноата сульфосукцинимидил-6-(биотинамидо) EZ-Link в соответствии с инструкцией производителя с 20-кратным молярным избытком реагента биотина для получения 4-6 биотиновых групп на молекулу антитела.
   заметка: Поликлональные антитела обычно используются для обнаружения, но моноклональные антитела также могут быть использованы, если они специфичны для эпитопа, отличного от антитела захвата.
   заметка: В качестве альтернативы для обнаружения можно использовать коммерчески доступные биотинилированные антитела.

3. Обнаружение микроорганизмов с помощью мультиплексного сэндвич-иммуноанализа

Связанные наборы микросфер и меченые антитела для обнаружения, полученные в пунктах 1 и 2 выше, используются в мультиплексированном сэндвич-иммуноанализе для обнаружения и количественного определения бактерий, присутствующих в образце. Обзор рабочего процесса анализа показан на рисунке 1.

1. Выберите стандартные флаконы наборов шариков MagPlex, связанных с антителами, при хранении при температуре 2-8ºC.
2. Вортексируйте и обрабатывайте ультразвуком в течение 20 секунд.
3. Приготовьте рабочую мультиплексированную смесь шариков таким образом, чтобы конечная концентрация каждого набора шариков составляла 2500 микросфер на 50 мкл для каждой реакционной лунки (50 000 гранул/набор/мл) в PBS-TBN.
   заметка: Используйте таблицу для определения параметров подготовки рабочей смеси для бисера.
   заметка: Внутренние контрольные бусины (микросферы монитора RP1) также могут быть включены для контроля качества анализа и работы прибора.
4. Пипеткой внесите 50 мкл рабочей смеси шариков в соответствующие лунки 96-луночного планшета.
5. Пипетка 50 мкл стандартной или выборочной в соответствующие лунки.
6. Пипеткой подайте 50 мкл PBS-TBN в каждую фоновую лунку.
7. Накройте пластину уплотнителем из фольги для защиты бусин от света и выдерживайте на вибростенде при комнатной температуре в течение 1 часа с встряхиванием при 800 оборотах в минуту.
8. Поместите пластину на магнитный разделитель пластин на 1 минуту.
9. Держа пластину на магнитном сепараторе пластин, осторожно снимите фольгу и переверните пластину, чтобы опорожнить лунки, после чего постучите для просушки на толстом слое лабораторных бумажных полотенец 3-4 раза. <бр/> заметка: В качестве альтернативы можно вручную отсасывать лунки с помощью многоканального пипеттора или использовать автоматизированную промывку пластин
.
10. С помощью многоканального дозатора добавьте 200 мкл PBS-TBN в каждую лунку и встряхивайте в течение 1 минуты на вибростенде со скоростью 800 об/мин.
11. Поместите пластину на магнитный разделитель пластин на 1 минуту.
12. Держа пластину на магнитном сепараторе пластин, переверните пластину для опорожнения лунок, затем постучите для просушки на толстом слое лабораторных бумажных полотенец 3-4 раза.<бр/> заметка: В качестве альтернативы можно вручную отсасывать лунки с помощью многоканального пипеттора или использовать автоматизированную промывку пластин
.
13. Повторите шаги 10-12 для получения в общей сложности двух стирок.
    заметка: Удалите как можно больше буфера, прежде чем переходить к следующему этапу, чтобы избежать потенциального разбавления реакции.
14. С помощью многоканального дозатора добавьте 50 мкл буфера для анализа в каждую лунку и встряхните в течение 1 минуты на вибростенде со скоростью 800 об/мин.
15. Разведите биотинилированное антитело обнаружения до 4 мкг/мл в PBS-TBN.
16. Добавьте по 50 мкл разведенного антитела для обнаружения в каждую лунку.
17. Накройте пластину уплотнителем из фольги для защиты бусин от света и выдерживайте на вибростенде при комнатной температуре в течение 1 часа с встряхиванием при 800 оборотах в минуту.
18. Поместите пластину на магнитный разделитель пластин на 1 минуту.
19. Держа пластину на магнитном сепараторе пластин, переверните пластину для опорожнения лунок, затем постучите для просушки на толстом слое лабораторных бумажных полотенец 3-4 раза.<бр/> заметка: В качестве альтернативы можно вручную отсасывать лунки с помощью многоканального пипеттора или использовать автоматизированную промывку пластин
.
20. Промойте каждую лунку два раза, следуя процедуре, описанной в шагах 10-12.<бр/> заметка: Удалите как можно больше буфера, прежде чем переходить к следующему этапу, чтобы избежать потенциального разбавления реакции.
21. С помощью многоканального дозатора добавьте 50 мкл буфера для анализа в каждую лунку и встряхните в течение 1 минуты на вибростенде со скоростью 800 об/мин. Стрептавидин, R-фикоэритрин конъюгат (SAPE).
22. Разбавьте репортер SAPE до 4 мкг/мл в буфере для анализа.
23. Добавьте по 50 мкл разведенного SAPE в каждую лунку.
24. Накройте пластину уплотнителем из фольги для защиты шариков и SAPE от света и выдерживайте на вибростенде при комнатной температуре в течение 30 минут с встряхиванием при 800 об/мин.
25. Поместите пластину на магнитный разделитель пластин на 1 минуту.
26. Держа пластину на магнитном сепараторе пластин, переверните пластину для опорожнения лунок, затем постучите для просушки на толстом слое лабораторных бумажных полотенец 3-4 раза.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно вручную отсасывать лунки с помощью многоканального пипеттора или использовать автоматическую промывку пластин.
27. Промойте каждую лунку два раза, следуя процедуре, описанной в шагах 10-12.
28. Добавьте 100 μL PBS-TBN в каждую лунку и встряхивайте в течение 1 минуты на вибростенде при 800 об/мин.
29. Анализируйте 50 мкл каждой реакции на анализаторе Luminex (в соответствии с руководством пользователя используемого анализатора), собирая не менее 50 гранул на набор шариков для анализа. Краткое описание xMAP INTELLIFLEX® приведено ниже.
    1. Выберите выпадающее меню в верхнем левом углу экрана и перейдите к разделу «Конфигурация пластины».
    2. Выберите Run Plate.
    3. Щелкните значок Извлечь, чтобы извлечь плитоноску.
    4. Загрузите пластину на держатель пластин и выберите значок Втянуть, чтобы втянуть держатель пластин.
    5. Выберите значок Выполнить, чтобы запустить пластину.

Результаты

Рисунок 1: Рабочий процесс сэндвич-иммуноферментного анализа с мультиплексным захватом. В каждую лунку дозируют мультиплексированную смесь микросфер, связанных с антителами, и добавляют образец. После инкубации в течение 1 часа реакции промывают, и добавляют биотинилированные антитела к детекции. После 1-часовой инкубации реакции снова промывают и добавляют репортер SAPE. Реакции инк...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микросферы MagPlex®	Люминекс®	MC100xx-YY	Индивидуальные каталожные номера см. на сайте (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#order)
Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл	Эппендорф™	22431081	Протеин LoBind®
0,1 М одноосновной фосфат натрия (2PO4), pH 6,2	МиллипорСигма	С3139	Буфер активации
1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимимид гидрохлорид (EDC)	Термо Сайентиал™	Пирс™ 77149
N-гидроксисульфосукцинимид (Sulfo-NHS)	Термо Сайентиал ™	Пирс™ 24510
Фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4	МиллипорСигма	П3813	Буфер сцепления
Набор для связывания антител xMAP®	Люминекс®	40-50016	Доступен дополнительный комплект для соединения микросфер.
Антитело к Escherichia coli O157:H7	СераКер	5310-0326	Поликлональный, используется как для захвата, так и для обнаружения
Антитела к сальмонелле CSA-Plus	СераКер	5310-0321	Поликлональный, используется как для захвата, так и для обнаружения
Антитела к Campylobacter spp.	СераКер	5310-0324 (Английский)	Поликлональный, используется как для захвата, так и для обнаружения
Антитела к листерии	СераКер	5310-0319 (Английский)	Поликлональный, геноспецифичный, используется как для захвата, так и для обнаружения
PBS, pH 7,4, содержащий 0,02% Tween-20, 0,1% BSA, 0,05% азида натрия (PBS-TBN)	МиллипорСигма	P3563 А7888<бр /> С8032	Можно использовать до 1% BSA
Антитела к кишечной палочке O157:H7	СераКер	5310-0326	Поликлональные
(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin) (Пирс).	Термо Сайентиал™	А39257
E. coli O157:H7	СераКер	5370-0013	Термически убитый
Сальмонелла серотип Typhimurium	СераКер	5370-0002 (Английский	Термически убитый
Campylobacter jejuni	СераКер	5370-0011	Термически убитый
Listeria monocytogenes	СераКер	5370-0010	Термически убитый
Стрептавидин, R-фикоэритрин конъюгат (SAPE)	Термо Сайентиал™	С866

)