$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Ковалентное связывание захватывающих антител с микросферами MagPlex
Каждое антитело захвата конъюгируется с определенным набором карбоксилированных магнитных микросфер с использованием двухэтапной процедуры, как описано ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также доступен комплект для связывания, включающий все реагенты, буферы и материалы, необходимые для соединения микросфер (см. ТАБЛИЦУ МАТЕРИАЛОВ).
- Восстановите суспензию неотсоединенной микросферной суспензии в соответствии с инструкциями, описанными в информационном листе продукта, прилагаемом к микросферам.
заметка: Инструкции по ресуспензии будут зависеть от размера и объема ваших стандартных флаконов с микросферами.
- Переложите 2,5 x 106 исходных микросфер в рекомендованную микроцентрифужную пробирку (см. ТАБЛИЦУ МАТЕРИАЛОВ).
- Поместите трубку в магнитный сепаратор и дайте отделителю произойти в течение 60 секунд.
Не снимая - трубку с магнитного сепаратора, удалите надосадочную жидкость.
заметка: Следите за тем, чтобы не потревожить микросферы.
- Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте микросферы в 100 мкл dH2O с помощью вихря и ультразвука в течение 20 секунд.
- Повторите шаги 3 и 4.
- Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте промытые микросферы 80 мкл 0,1 М одноосновного фосфата натрия, pH 6,2 вихревым действием и ультразвуком в течение 20 секунд.
- Добавьте 10 мкл N-гидроксисульфосукцинимида 50 мг/мл (сульфо-NHS) (разведенного в 0,1 М одноосновного фосфата натрия, pH 6,2) к микросферам и аккуратно перемешайте вихрем.
- Добавьте 10 мкл 50 мг/мл 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида гидрохлорида (EDC) (разведенного в 0,1 М одноосновного фосфата натрия, pH 6,2) к микросферам и аккуратно перемешайте вихрем.
- Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре с аккуратным перемешиванием вихрем с 10-минутными интервалами.
- Поместите трубку в магнитный сепаратор и дайте отделителю произойти в течение 60 секунд.
Не снимая - трубку с магнитного сепаратора, удалите надосадочную жидкость.
заметка: Следите за тем, чтобы не потревожить микросферы.
- Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте микросферы в 250 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), pH 7,4 с помощью вихря и ультразвука в течение примерно 20 секунд.
- Поместите трубку в магнитный сепаратор и дайте отделителю произойти в течение 60 секунд.
Не снимая - трубку с магнитного сепаратора, удалите надосадочную жидкость.
заметка: Следите за тем, чтобы не потревожить микросферы.
- Повторите шаги 13-15 в общей сложности два мытья.
- Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте активированные и промытые микросферы в 100 мкл PBS, pH 7,4 по вихревому и ультразвуковому воздействию примерно на 20 секунд.
- Добавьте 12,5 мкг антитела захвата к ресуспендированным микросферам (т.е. 5 мкг/1 миллион микросфер).
заметка: Моноклональные антитела предпочтительны для захвата, но также могут быть использованы поликлональные антитела.
ПРИМЕЧАНИЕ: 5 μг белка на 1 миллион бусин обычно хорошо работают, но мы рекомендуем титровать количество для достижения оптимальных результатов анализа.
- Доведите общий объем до 500 μл с PBS, pH 7,4.
- Смешайте реакцию сопряжения вихрем.
- Выдерживать в течение 2 часов с перемешиванием путем вращения при комнатной температуре в темноте.
- Поместите трубку в магнитный сепаратор и дайте отделителю произойти в течение 60 секунд.
Не снимая - трубку с магнитного сепаратора, удалите надосадочную жидкость.
заметка: Следите за тем, чтобы не потревожить микросферы.
- Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте связанные микросферы в 1 мл PBS, pH 7,4, содержащем 0,02% Tween-20, 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,05% азида натрия (PBS-TBN) вихревым и ультразвуковым током в течение 20 секунд.
- Поместите трубку в магнитный сепаратор и дайте отделителю произойти в течение 60 секунд.
Не снимая - трубку с магнитного сепаратора, удалите надосадочную жидкость.
заметка: Следите за тем, чтобы не потревожить микросферы.
- Повторите шаги 24-26 в общей сложности два мытья.
- Извлеките трубку из магнитного сепаратора и снова суспендируйте связанные микросферы в 500 мкл PBS-TBN.
заметка: Определите количество восстановленных микросфер с помощью клеточного счетчика или гемоцитометра.
- Хранить спаренные микросферы в холодильнике при температуре 2-8°C в темноте.<бр/>
заметка: Также доступен протокол для подтверждения эффективности муфты.
2. Мечение антител к обнаружению биотином
- Антитела к детекции мечали биотином с помощью гексаноата сульфосукцинимидил-6-(биотинамидо) EZ-Link в соответствии с инструкцией производителя с 20-кратным молярным избытком реагента биотина для получения 4-6 биотиновых групп на молекулу антитела.
заметка: Поликлональные антитела обычно используются для обнаружения, но моноклональные антитела также могут быть использованы, если они специфичны для эпитопа, отличного от антитела захвата.
заметка: В качестве альтернативы для обнаружения можно использовать коммерчески доступные биотинилированные антитела.
3. Обнаружение микроорганизмов с помощью мультиплексного сэндвич-иммуноанализа
Связанные наборы микросфер и меченые антитела для обнаружения, полученные в пунктах 1 и 2 выше, используются в мультиплексированном сэндвич-иммуноанализе для обнаружения и количественного определения бактерий, присутствующих в образце. Обзор рабочего процесса анализа показан на рисунке 1.
- Выберите стандартные флаконы наборов шариков MagPlex, связанных с антителами, при хранении при температуре 2-8ºC.
- Вортексируйте и обрабатывайте ультразвуком в течение 20 секунд.
- Приготовьте рабочую мультиплексированную смесь шариков таким образом, чтобы конечная концентрация каждого набора шариков составляла 2500 микросфер на 50 мкл для каждой реакционной лунки (50 000 гранул/набор/мл) в PBS-TBN.
заметка: Используйте таблицу для определения параметров подготовки рабочей смеси для бисера.
заметка: Внутренние контрольные бусины (микросферы монитора RP1) также могут быть включены для контроля качества анализа и работы прибора.
- Пипеткой внесите 50 мкл рабочей смеси шариков в соответствующие лунки 96-луночного планшета.
- Пипетка 50 мкл стандартной или выборочной в соответствующие лунки.
- Пипеткой подайте 50 мкл PBS-TBN в каждую фоновую лунку.
- Накройте пластину уплотнителем из фольги для защиты бусин от света и выдерживайте на вибростенде при комнатной температуре в течение 1 часа с встряхиванием при 800 оборотах в минуту.
- Поместите пластину на магнитный разделитель пластин на 1 минуту.
- Держа пластину на магнитном сепараторе пластин, осторожно снимите фольгу и переверните пластину, чтобы опорожнить лунки, после чего постучите для просушки на толстом слое лабораторных бумажных полотенец 3-4 раза. <бр/>
заметка: В качестве альтернативы можно вручную отсасывать лунки с помощью многоканального пипеттора или использовать автоматизированную промывку пластин
.
- С помощью многоканального дозатора добавьте 200 мкл PBS-TBN в каждую лунку и встряхивайте в течение 1 минуты на вибростенде со скоростью 800 об/мин.
- Поместите пластину на магнитный разделитель пластин на 1 минуту.
- Держа пластину на магнитном сепараторе пластин, переверните пластину для опорожнения лунок, затем постучите для просушки на толстом слое лабораторных бумажных полотенец 3-4 раза.<бр/>
заметка: В качестве альтернативы можно вручную отсасывать лунки с помощью многоканального пипеттора или использовать автоматизированную промывку пластин
.
- Повторите шаги 10-12 для получения в общей сложности двух стирок.
заметка: Удалите как можно больше буфера, прежде чем переходить к следующему этапу, чтобы избежать потенциального разбавления реакции.
- С помощью многоканального дозатора добавьте 50 мкл буфера для анализа в каждую лунку и встряхните в течение 1 минуты на вибростенде со скоростью 800 об/мин.
- Разведите биотинилированное антитело обнаружения до 4 мкг/мл в PBS-TBN.
- Добавьте по 50 мкл разведенного антитела для обнаружения в каждую лунку.
- Накройте пластину уплотнителем из фольги для защиты бусин от света и выдерживайте на вибростенде при комнатной температуре в течение 1 часа с встряхиванием при 800 оборотах в минуту.
- Поместите пластину на магнитный разделитель пластин на 1 минуту.
- Держа пластину на магнитном сепараторе пластин, переверните пластину для опорожнения лунок, затем постучите для просушки на толстом слое лабораторных бумажных полотенец 3-4 раза.<бр/>
заметка: В качестве альтернативы можно вручную отсасывать лунки с помощью многоканального пипеттора или использовать автоматизированную промывку пластин
.
- Промойте каждую лунку два раза, следуя процедуре, описанной в шагах 10-12.<бр/>
заметка: Удалите как можно больше буфера, прежде чем переходить к следующему этапу, чтобы избежать потенциального разбавления реакции.
- С помощью многоканального дозатора добавьте 50 мкл буфера для анализа в каждую лунку и встряхните в течение 1 минуты на вибростенде со скоростью 800 об/мин. Стрептавидин, R-фикоэритрин конъюгат (SAPE).
- Разбавьте репортер SAPE до 4 мкг/мл в буфере для анализа.
- Добавьте по 50 мкл разведенного SAPE в каждую лунку.
- Накройте пластину уплотнителем из фольги для защиты шариков и SAPE от света и выдерживайте на вибростенде при комнатной температуре в течение 30 минут с встряхиванием при 800 об/мин.
- Поместите пластину на магнитный разделитель пластин на 1 минуту.
- Держа пластину на магнитном сепараторе пластин, переверните пластину для опорожнения лунок, затем постучите для просушки на толстом слое лабораторных бумажных полотенец 3-4 раза.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно вручную отсасывать лунки с помощью многоканального пипеттора или использовать автоматическую промывку пластин.
- Промойте каждую лунку два раза, следуя процедуре, описанной в шагах 10-12.
- Добавьте 100 μL PBS-TBN в каждую лунку и встряхивайте в течение 1 минуты на вибростенде при 800 об/мин.
- Анализируйте 50 мкл каждой реакции на анализаторе Luminex (в соответствии с руководством пользователя используемого анализатора), собирая не менее 50 гранул на набор шариков для анализа. Краткое описание xMAP INTELLIFLEX® приведено ниже.
- Выберите выпадающее меню в верхнем левом углу экрана и перейдите к разделу «Конфигурация пластины».
- Выберите Run Plate.
- Щелкните значок Извлечь, чтобы извлечь плитоноску.
- Загрузите пластину на держатель пластин и выберите значок Втянуть, чтобы втянуть держатель пластин.
- Выберите значок Выполнить, чтобы запустить пластину.
