Выделение и расщепление нейтрофильных белков

Аннотация

Это видео демонстрирует выделение белка из нейтрофилов, который далее обрабатывается и переваривается в более мелкие пептиды. Эти пептиды могут быть использованы для будущего анализа.

Протокол

1. Сбор и лизис нейтрофильных клеток

1. Соберите нейтрофил-дифференцированные клетки HL60 в пробирку объемом 15 мл путем центрифугирования образцов при давлении 400 x g в течение 5 мин.
   заметка: После дифференцировки нейтрофилы должны находиться в конфлюенции 3,5 x 10 5 клеток/мл. Соберите около пяти миллионов клеток для полной экстракции протеома.
2. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в пробирку 15 мл фосфатно-буферного раствора (PBS).
3. Центрифугируйте образцы при плотности 400 x g в течение 5 минут.
4. Повторите шаги с 1.2 по 1.3.
   заметка: Образцы клеток могут быть мгновенно заморожены жидким азотом и храниться при температуре -80°C после этапа 1.4, в зависимости от временных рамок эксперимента.
5. Добавьте в каждый образец 300 мкл холодного 100 мМ трис (гидроксиметил) аминометана гидрохлорида (Трис-HCl) pH 8,5, содержащего коктейль ингибиторов протеиназы (PIC).
6. Кратко сэмплируем Vortex.
7. Добавьте 1/10 объема 20% SDS к конечной концентрации 2% SDS.
8. Чтобы лизировать образцы клеток, зондируйте образцы ультразвуком в ледяной бане в течение 30 секунд и выключения в течение 30 секунд в течение пяти циклов при мощности 10%.
9. Центрифуга для отбора образцов на коротком отжиме (макс. скорость 5-10 сек.). <бр/> заметка: Не допускайте попадания гранул мусора в клетку. Используйте короткий отжим, чтобы собрать распылитель со стенок трубки.
10. Перенесите образцы из пробирки объемом 15 мл в пробирку объемом 2 мл.
11. Добавьте 1/10 объема 1 М стокового дитиотреитола (ДТТ) до конечной концентрации 10 мМ ДТТ.
12. Кратко сэмплируем Vortex.
13. Инкубируйте образцы в течение 10 минут с встряхиванием при 800 об/мин при 95°C.
14. Через 10 минут охладите образцы до комнатной температуры.
    заметка: Образцы могут быть помещены в лед для ускорения процесса охлаждения.
15. Добавьте 1/10 объема 0,55 мМ йодоацетамида (IAA) к конечной концентрации 55 мМ IAA.
    заметка: Выполните шаг 1.15 в темноте, чтобы не подвергать IAA воздействию света.
16. Кратко сэмплируем Vortex.
17. Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте.
18. Добавьте 100% ледяной ацетон в конечной концентрации 80% и храните образцы при температуре -20 °C в течение ночи. <бр/> заметка: При необходимости хранение при температуре -20 °C может быть выполнено до двух недель.

2. Расщепление нейтрофильных белков

1. Центрифугируйте образцы при 13 500 об/мин при 4°C в течение 10 минут для осаждения гранул клеток.
2. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулы ячейки 500 μл 80% ледяного ацетона.
3. Центрифугируйте образцы при 13 500 об/мин при 4 °C в течение 10 мин и удалите надосадочную жидкость.
4. Повторите шаги с 2.1 по 2.3.
5. Воздушно-сухие пеллеты.
6. После высыхания добавьте 100 μл 8 М мочевины/40 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтанасульфоновой кислоты (HEPES) в клеточную гранулу и обработайте водой на водяной бане при температуре 4°C в течение 30 секунд и выключений, в течение 15 циклов для повторного растворения белковых гранул.
7. С помощью анализа на бычий сывороточный альбумин (БСА) триптофана (или его эквивалента) количественно определяют концентрацию белка в соответствии с инструкциями производителя.
8. Добавьте 300 мкл бикарбоната аммония (ABC), чтобы разбавить образец до конечной концентрации 2 М мочевины.
9. Чтобы переварить 50 г белка, добавьте 1:50 трипсина/LysC (соотношение ферментов и белков) в образцы на льду — перемешайте образцы, слегка постукивая.
10. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение ночи для выполнения пищеварения.

Результаты

Рисунок 1. Рабочий процесс дифференцировки клеток HL60 в нейтрофилы для протеомного профилирования на основе масс-спектрометрии. Недифференцированные и дифференцированные (с помощью химической стимуляции ДМСО) клеточные линии HL60 культивировали, собирали и обрабатывали для полной экстракции протеома. Белки расщепляли с помощью Trypsin/LysC, а пептиды очищали с помощью C18 STAGE-tips с последующим де...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
15 мл Falcon Tube	ВВР	470225-000
25 мл серологических	Научный центр Фишера	14955235
Бикарбонат аммония (ABC)	ThermoFisher Scientific	А643-500
ацетон	Сигма Олдрич	34850-1л
Набор для анализа BSA	ВВР	CA62408-940
Центрифуга 5810 R	Сигма Олдрич	EP022628188
Дитиотреитол (DTT)	ThermoFisher Scientific	Р0861	Подготовьте 1М запас аликвот DTT и храните при температуре -20°C
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Разморозить, подготовить аликвоты и хранить при температуре -20°C
Нагревательный блок
ХЕПЕС	Сигма Олдрич	Н3375	Приготовьте аликвоты 8М мочевины/40м HEPES, храните при -20 °C
Йодоацетамид (ИУК)	Научный центр Фишера	AAA1471514	Подготовьте 0,55 млн запасов аликвот IAA и храните при температуре -20°C. Избегайте воздействия света
L-глютамин	Научный центр Фишера	25030081	Разморозить, подготовить аликвоты и хранить при температуре -20°C
Жидкий азот
Микроцентрифужные пробирки LoBind	Эппендорф	Тел.: 13-698-794
Пенициллин, стрептомицин, амфотерицин	Сигма Олдрич	А5955	Разморозить, подготовить аликвоты и хранить при температуре -20°C
Нейтрофил-дифференцированные клетки HL60
Фосфатно-буферный раствор (PBS)	Биошоп	ПБС408	Хранить при комнатной температуре
Ультразвуковая обработка щупом	Научный центр Фишера	Тел.: 100-132-894
Коктейль ингибиторов протеазы (PIC) в таблетках	Сигма Олдрич	5892791001	Хранить при температуре 4°C
РПМИ 1640	ThermoFisher Scientific	11875093	Хранить при температуре 4°C
Додецилсульфат натрия (SDS)	ThermoFisher Scientific	J18220. А1	готовим 2% раствор SDS
Центрифуга SpeedVac	Эппендорф	Тел.: 07-748-15
Колбы T75	ThermoFisher Scientific	156499
Трис HCL pH 8,5	Научный центр Фишера	БП152-1	Хранить при температуре 4°C
Ультразвуковая ванна	ВВР	97043-960
мочевина	Биошоп	УРЕ001.1