Выделение и расщепление нейтрофильных белков

Аннотация

Это видео демонстрирует выделение белка из нейтрофилов, который далее обрабатывается и переваривается в более мелкие пептиды. Эти пептиды могут быть использованы для будущего анализа.

Протокол

1. Сбор и лизис нейтрофильных клеток

1. Соберите нейтрофил-дифференцированные клетки HL60 в пробирку объемом 15 мл путем центрифугирования образцов при давлении 400 x g в течение 5 мин.
   заметка: После дифференцировки нейтрофилы должны находиться в конфлюенции 3,5 x 10 5 клеток/мл. Соберите около пяти миллионов клеток для полной экстракции протеома.
2. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в пробирку 15 мл фосфатно-буферного раствора (PBS).
3. Центрифугируйте образцы при плотности 400 x g в течение 5 минут.
4. Повторите шаги с 1.2 по 1.3.
   заметк....

Результаты

Рисунок 1. Рабочий процесс дифференцировки клеток HL60 в нейтрофилы для протеомного профилирования на основе масс-спектрометрии. Недифференцированные и дифференцированные (с помощью химической стимуляции ДМСО) клеточные линии HL60 культивировали, собирали и обрабатывали для полной экстракции протеома. Белки расщепляли с помощью Trypsin/LysC, а пептиды очищали с помощью C18 STAGE-tips с последующим де.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
15 мл Falcon Tube	ВВР	470225-000
25 мл серологических	Научный центр Фишера	14955235
Бикарбонат аммония (ABC)	ThermoFisher Scientific	А643-500
ацетон	Сигма Олдрич	34850-1л
Набор для анализа BSA	ВВР	CA62408-940
Центрифуга 5810 R	Сигма Олдрич	EP022628188
Дитиотреитол (DTT)	ThermoFisher Scientific	Р0861	Подготовьте 1М запас аликвот DTT и храните при температуре -20°C
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Разморозить, подготовить аликвоты и хранить при температуре -20°C
Нагревательный блок
ХЕПЕС	Сигма Олдрич	Н3375	Приготовьте аликвоты 8М мочевины/40м HEPES, храните при -20 °C
Йодоацетамид (ИУК)	Научный центр Фишера	AAA1471514	Подготовьте 0,55 млн запасов аликвот IAA и храните при температуре -20°C. Избегайте воздействия света
L-глютамин	Научный центр Фишера	25030081	Разморозить, подготовить аликвоты и хранить при температуре -20°C
Жидкий азот
Микроцентрифужные пробирки LoBind	Эппендорф	Тел.: 13-698-794
Пенициллин, стрептомицин, амфотерицин	Сигма Олдрич	А5955	Разморозить, подготовить аликвоты и хранить при температуре -20°C
Нейтрофил-дифференцированные клетки HL60
Фосфатно-буферный раствор (PBS)	Биошоп	ПБС408	Хранить при комнатной температуре
Ультразвуковая обработка щупом	Научный центр Фишера	Тел.: 100-132-894
Коктейль ингибиторов протеазы (PIC) в таблетках	Сигма Олдрич	5892791001	Хранить при температуре 4°C
РПМИ 1640	ThermoFisher Scientific	11875093	Хранить при температуре 4°C
Додецилсульфат натрия (SDS)	ThermoFisher Scientific	J18220. А1	готовим 2% раствор SDS
Центрифуга SpeedVac	Эппендорф	Тел.: 07-748-15
Колбы T75	ThermoFisher Scientific	156499
Трис HCL pH 8,5	Научный центр Фишера	БП152-1	Хранить при температуре 4°C
Ультразвуковая ванна	ВВР	97043-960
мочевина	Биошоп	УРЕ001.1