Процедура STAGE Tip для обессоливания и очистки пептидов

Аннотация

Это видео демонстрирует очистку пептидов с помощью процедуры STAGE Tip. Миниатюрная колонка, содержащая гранулы смолы, связанные с длинными цепочками углеводородов, способствует очистке на основе гидрофобного взаимодействия. При загрузке предварительно переваренного образца пептида в колонку фрагменты пептида связываются с гранулами смолы, пропуская примеси. Для элюирования пептидных фрагментов применяется элюирующий буфер, который нарушает гидрофобное взаимодействие.

Протокол

1. Очистка и обессоливание пептидов

1. Упакуйте три слоя смолы C18 в наконечник для дозатора объемом 200 мкл для каждого образца пептида, чтобы создать наконечник STop And Go Extraction (STAGE).
2. Добавьте в образцы 1/10 останавливающего раствора (20% ацетонитрил [ACN)] и 6% трифторуксусную кислоту [TFA]).
3. Центрифужные образцы для осаждения гранул при 13 200 об/мин в течение 10 мин.
4. Переложите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 2 мл и выбросьте гранулу.
5. Промойте наконечники ступени 100 μл 100% ACN.
6. Наконечники центрифуги STAGE при 1000 x g в течение 2 мин.<бр/> заметка: Центрифуга STAGE опрокидывается до тех пор, пока вся жидкость не пройдет через смолу C18.
7. Промойте наконечники STAGE с 50 μл буфера B (80% ACN, 0,5% уксусной кислоты и ddH₂O).
8. Центрифуга STAGE нагружает при 1000 x g в течение 2 мин.
9. Промойте наконечники STAGE с 200 μл буфера A (2% ACN, 0,1% TFA, 0,5% уксусной кислоты и ddH₂O).
10. Кончики ступени центрифуги при 1000 x g в течение 2 минут.
11. Загрузите образцы в наконечники STAGE.
12. Центрифугируйте образцы при давлении 1000 х г в течение 3-5 мин.
13. Промойте наконечники STAGE буфером 200 μl.
14. Центрифугируйте при 1000 х г в течение 3-5 минут.
15. Добавьте 50 μл буфера B в каждый наконечник STAGE
16. С помощью шприца элюируйте образцы, содержащие буфер B, в ПЦР-полоску объемом 0,2 мл.
17. После того, как образцы будут элюированы, высушите пептиды с помощью вакуумной центрифуги в течение 45 минут.
18. Как только образцы высохнут, храните их при комнатной температуре до MS.
    заметка: Если необходимо хранение пептидов более двух недель, мы рекомендуем хранить при температуре -20°C.
19. Запустите образец с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения (MS).
    заметка: Параметры измерения образца (например, количество загруженного образца, длина градиента жидкостной хроматографии, разрешение) будут зависеть от используемого прибора.

2. Протеомное профилирование нейтрофилов

1. Обработка исходных данных
   1. Загрузите файлы Raw данных, полученные из MS, в MaxQuant.
   2. Программное обеспечение предназначено для работы с восходящими файлами сбора данных, и многие параметры по умолчанию оптимизированы для таких образцов. Стандартные параметры включают в себя переваривание (трипсин P), вариабельные модификации окисления метионина (окисление (M)) и N-ацетилирование белков (ацетил (белок N-term)), а также фиксированные модификации карбамидометилирования цистеина (карбамидометил (C)).
   3. Корректировка этих параметров включает в себя количественную оценку без меток (LFQ; установите минимальное количество отношений равным 1), соответствие между прогонами (т. е. вкл/выкл) и минимальное количество пептидов, идентифицированных на каждый белок (рекомендуется установить значение 2).
   4. В глобальных параметрах импортируем файл FASTA для идентификации последовательности. Для этого эксперимента был использован файл FASTA Homo sapiens (Человек) (UP000005640) из базы данных Uniprot. заметка: Запишите следующую информацию для ведения учета: Идентификатор организма = 9606; количество белков = 79,740; Дата загрузки файла.
   5. Задайте количество ядер компьютера, которые будут использоваться для обработки, и нажмите кнопку Пуск.
   6. После завершения работы MaxQuant будет сгенерирована «объединенная» папка вместе с другими файлами.
      заметка: Другие файлы могут быть использованы для идентификации пептидов, модификаций и т. д., а также могут потребоваться для загрузки полного набора данных в репозитории данных, включая Proteome Xchange (PRIDE).
2. Анализ и визуализация данных в Perseus
   1. Загрузите 'proteingroups.txt' в Perseus и выберите все файлы интенсивности LFQ для окна 'Main'.
      заметка: Базовая информация импортируется непосредственно в окна Персея, но другую информацию (например, сайты модификаций) может потребоваться добавить вручную.
   2. Фильтруйте ряды, удаляя загрязняющие вещества, обратные пептиды и пептиды, идентифицированные только по участку.
   3. Преобразуйте данные с помощью log₂(x).
   4. Чтобы наблюдать за количеством белков, обнаруженных в каждой реплике, постройте числовую диаграмму Венна.
   5. Установите категориальные аннотации для каждого образца.
      заметка: Для статистических целей все реплики одного биологического образца должны иметь одно и то же название.
   6. Фильтруйте строки на основе допустимых значений, при этом белок идентифицирован в >50% реплик и по крайней мере в пределах одной группы.
      заметка: Фильтрация по допустимым значениям может быть более строгой, в зависимости от настройки эксперимента и целей (например, белок должен присутствовать во всех образцах).
   7. Чтобы заменить отсутствующие значения для LFQ, можно выполнить импутацию из нормального распределения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: параметры по умолчанию оптимизированы для данных LFQ, но могут быть скорректированы по желанию.
   8. Добавьте информацию об аннотациях к строкам белка. Добавьте файл txt.gz FASTA (полученный с веб-сайта Perseus) в папки 'bin', 'conf' и 'annotation' и добавьте конкретные термины (например, названия белков, названия генов, онтологию генов).
   9. Теперь матрица завершена и может быть использована для статистического тестирования (например, ANOVA, t-тестов) для определения значительных изменений в содержании белка между тестируемыми условиями. Другие формы инструментов визуализации включают графики анализа главных компонент, тепловые карты и обогащение категорий.
      заметка: Информация об аннотациях также может быть загружена из UniProt и интегрирована в фреймворк Perseus.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
15 мл Falcon Tube	ВВР	470225-000
25 мл серологических	Научный центр Фишера	14955235
Бикарбонат аммония (ABC)	ThermoFisher Scientific	А643-500
уксусная кислота	Сигма Олдрич	1099510001
ацетон	Сигма Олдрич	34850-1л
Ацетонитрил (АКЦ), степень рассеянного склероза	прокалывать	ТС-51101
Набор для анализа BSA	ВВР	CA62408-940
Диски C18 (наконечники STAGE)	Научный центр Фишера	13110019
Центрифуга 5810 R	Сигма Олдрич	EP022628188
Дитиотреитол (DTT)	ThermoFisher Scientific	Р0861	Подготовьте 1М запас аликвот DTT и храните при температуре -20°C
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Разморозить, подготовить аликвоты и хранить при температуре -20°C
ХЕПЕС	Сигма Олдрич	Н3375	Приготовьте аликвоты 8М мочевины/40м HEPES, храните при -20 °C
Масс-спектрометр высокого разрешения	ThermoFisher Scientific	726042
Йодоацетамид (ИУК)	Научный центр Фишера	AAA1471514	Подготовьте 0,55 млн запасов аликвот IAA и храните при температуре -20°C. Избегайте воздействия света
L-глютамин	Научный центр Фишера	25030081	Разморозить, подготовить аликвоты и хранить при температуре -20°C
Микроцентрифужные пробирки LoBind	Эппендорф	Тел.: 13-698-794
МаксКвант	https://www.maxquant.org/
Стрип-пробирки для ПЦР	ВВР	76318-802
Пенициллин, стрептомицин, амфотерицин	Сигма Олдрич	А5955	Разморозить, подготовить аликвоты и хранить при температуре -20°C
Персей	https://www.maxquant.org/Perseus/
фосфатно-буферный раствор (PBS)	Биошоп	ПБС408	Хранить при комнатной температуре
Ультразвуковая обработка щупом	Научный центр Фишера	Тел.: 100-132-894
Коктейль ингибиторов протеазы (PIC) в таблетках	Сигма Олдрич	5892791001	Хранить при температуре 4°C
РПМИ 1640	ThermoFisher Scientific	11875093	Хранить при температуре 4°C
Додецилсульфат натрия (SDS)	ThermoFisher Scientific	J18220. А1	готовим 2% раствор SDS
Центрифуга SpeedVac	Эппендорф	Тел.: 07-748-15
Опрокидывающаяся центрифуга STAGE	Сонация	СТК-В2
Колбы T75	ThermoFisher Scientific	156499
Трифторуксусная кислота	ThermoFisher Scientific	No 85183
Трис HCL pH 8,5	Научный центр Фишера	БП152-1	Хранить при температуре 4°C
Трипсин/LysC	Thermo Fisher Scientific	А40009	и хранить при температуре -20°C
Ультразвуковая ванна	ВВР	97043-960
мочевина	Биошоп	УРЕ001.1