$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Анализ нейтрализации на основе псевдотипов
ПРИМЕЧАНИЕ: pMN - это опосредованная ингибированием вируса псевдотипа (PV) трансдукцией через образцы сыворотки крови человека, которые содержат антитела, направленные против шипа SARS-CoV-2.
- В 96-луночный белый планшет с помощью многоканальной пипетки добавьте 50 мкл модифицированной орлиной среды (DMEM) от Dulbecco, 10% бычьей сыворотки плода (FBS), 1% пенициллин/стрептомицин (Pen/Strep) в строки от B до H, столбцы 1-12.
- Добавьте 5 мкл сыворотки выздоравливающих в лунки строки А, столбцы 2-10, в общем объеме 100 мкл DMEM/10% FBS/1% P/S. Добавьте известное количество (например, 5 мкл) положительных (NIBSC 20/162 калибр, HICC-пул 2 или пул HICC 3) и отрицательных антисывороток (сыворотки пациентов, взятые до 2019 года) в лунки А11 и А12 в качестве контроля.
- Удалите 50 μл из лунок ряда А и выполните двукратное серийное разведение по всем лункам под ним.
- На каждом этапе разбавления используйте многоканальную пипетку для смешивания 5-10 раз, пипетируя вверх и вниз, стараясь не образовывать пузырьки воздуха.
- После завершения серийного разбавления последние 50 мкл из конечной лунки каждой колонны должны быть отбракованы.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе каждая лунка должна содержать 50 μл смешанных DMEM и серийных разведений сывороток пациентов или контрольных сывороток.
- Центрифужная пластина в течение 1 минуты при 500 об/мин, чтобы убедиться, что на стенках лунки не осталось жидкости.
- Используя данные, полученные с помощью титрования псевдотипов, рассчитайте количество DMEM, необходимое для разбавления вашего SARS-CoV-2 PV, чтобы получить 5 x 106 RLU в 50 μл, с общим объемом 5 мл.
- Смешайте этот разбавленный раствор PV в тазу для дозатора с помощью многоканальной пипетки и внесите по 50 мкл в каждую лунку на планшете, за исключением лунок A6-A12 (контрольные только ячейки). А1-А6 будет служить только для управления фотоэлектрическими установками.
- Центрифужная пластина в течение 1 минуты при 500 об/мин, чтобы убедиться, что на стенках лунки не осталось вируса.
- Инкубируйте планшеты в течение 1 ч при 37 °C 5% углекислого газа (CO2), давая сыворотке время для связывания гликопротеина SARS-CoV-2.
- Приготовьте планшет из клеток-мишеней HEK 293T/17, трансфицированных за 24 ч до этого плазмидой экспрессии ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2) и плазмидами экспрессии трансмембранной сериновой протеазы 2 (TMPRSS2).
- Удалите питательные среды из тарелки.
- Дважды вымойте тарелку с 2 мл PBS с одной стороны посуды, чтобы избежать отслоения клеток, и выбросьте.
- Добавьте в тарелку 2 мл трипсина и поставьте тарелку в инкубатор до тех пор, пока ячейки не отделятся.
- После того, как клетки отделятся, добавьте в пластину 6 мл DMEM/10% FBS/1% пенициллина/стрептомицина, чтобы погасить активность трипсина и мягко ресуспендировать клетки.
- Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек TC20TM или предметного стекла счетной камеры и добавьте в каждую лунку 1 x 104 ячейки общим объемом 50 мкл.
- Инкубируйте планшет в течение 48-72 часов при температуре 37 °C, 5%CO2.
- Считывайте показания с помощью системы анализа люциферазы Bright GloTM на микропланшетном люминометре GloMax® Navigator, удаляя питательную среду из всех лунок и добавляя 25 мкл смеси PBS: реагент для анализа люциферазы Bright GloTM в соотношении 1:1.
- На основе исходных данных, полученных люминометром, рассчитайте половину максимальной ингибиторной концентрации (IC50) титров нейтрализующих антител в соответствии с установленными протоколами. Значения IC50 ниже 1:40 разбавления считаются отрицательными. В качестве альтернативы данные могут быть оценены с помощью AutoPlate.