Анализы для качественной и количественной оценки концентрации глюкозы в моче мышей

Аннотация

Это видео демонстрирует процедуру сбора мочи мыши и оценки уровня глюкозы в ней. Чтобы оценить уровень глюкозы, погружают в образец тест-полоску, покрытую ферментами и хромогенным красителем, инициируя изменение цвета, указывающее на уровень глюкозы. Для количественного определения уровня глюкозы в моче введите образец мочи в многолуночный планшет с возрастающей концентрацией глюкозы, добавьте реакционную смесь и инкубируйте. Измерьте абсорбцию для создания стандартной кривой и рассчитайте уровень глюкозы на основе абсорбции образца.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Точечный тест на глюкозу в моче

1. Положите кусок чистой парапленки на ровную поверхность.
2. Аккуратно возьмите мышку за хвост и установите ее на парапленку.
3. Зафиксируйте мышь за загривок с помощью большого и указательного пальцев. Осторожно возьмите мышь, удерживая ее за загривок, в результате чего мышь начнет мочиться в ответ на стресс. Не допускайте, чтобы капля мочи упала на поверхность парапленки. Верните мышь в клетку после сбора капли мочи.
4. Окуните конец реагента полоски Diastix в свежую каплю мочи, собранную на поверхности Parafilm. Немедленно снимите полоску и положите ее на поверхность цветной стороной вверх. Подождите не менее 30 секунд, чтобы цвет полностью раскрылся на полоске. Сравните полученный цвет с эталонной таблицей, представленной на контейнере Diastix (рисунок 1).
   Советы: Если мышь не мочится на парапленку, слегка надавите указательным пальцем на нижнюю часть живота мыши (вокруг мочевого пузыря). Такой подход поможет выпустить капли мочи на парапленку. Для мышей, которые не мочатся после выполнения описанной выше процедуры, подождите 20 минут и начните процедуру снова. Убедитесь, что все процедуры выполняются в соответствии с рекомендациями IACUC.

2. Сбор мочи за 24 часа с использованием метаболической клетки мыши

1. Соберите метаболическую клетку Tecniplast (Рисунок 2) в соответствии с инструкциями производителя.
2. Заполните подающий узел порошкообразным кормом, а затем прикрепите подающий узел к соответствующему металлическому язычку на верхней камере.
3. Закрепите опору для бутылки с водой на оставшемся металлическом язычке в верхней камере.
4. Наполните пустую бутылку водой, а затем вставьте ее в опору для бутылки, убедившись, что трубка сиппера находится в отверстии.
5. Поместите мышь в метаболическую клетку, а затем накройте ее крышкой.
6. Убедитесь, что крышка клетки установлена правильно.
7. Расположите трубку для сбора мочи и трубку для сбора кала в соответствующих местах на нижнем дне камеры.
8. Через 24 ч извлеките пробирку для сбора мочи и выполните анализ глюкозы для определения концентрации глюкозы в моче. Если анализ глюкозы не проводится в тот же день, заморозьте образец мочи в морозильной камере при температуре -80°C.

3. Определение концентрации глюкозы в моче за 24 часа

1. Если образец мочи хранится при температуре -80°C, дайте ему оттаять перед проведением анализа глюкозы.
2. Из запаса 100 мг/дл приготовьте восемь стандартов в диапазоне от 25 мг/дл до 0 мг/дл в соответствии с инструкциями набора для анализа.
3. Подготовьте стандартные лунки и лунки для образцов мочи в 96-луночной пластине, все в двух экземплярах, в соответствии с инструкцией по набору.
4. После начала реакции путем добавления рекомендуемого количества ферментной смеси во все лунки, накройте планшет крышкой и дайте ему инкубироваться в течение 10 минут при 37°C.
5. Поглощение считывания на длине волны 500-520 нм с помощью планшетного ридера.
6. Анализируйте данные в соответствии с инструкциями пробирного набора. Составьте график зависимости абсорбции каждого стандарта от концентрации глюкозы и используйте график для определения концентрации глюкозы в образце мочи за 24 часа.

Результаты

Рисунок 1. Точечный анализ мочи на глюкозу. Капли мочи мыши, собранные на Parafilm, и цветная справочная таблица, предоставленная на контейнере Diastix.

Рисунок 2. Метаболическая клетка Tecniplast для сбора мочи у мышей в течение 24 часов.