Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Получение белка антигена MRSA HI
- Получение клонов фактора поверхностного определения ионов Fe B (IsdB) и мутантного α-гемолизина (Hla) из коммерческих источников (см. таблицу материалов), проведение амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации генов IsdB и Hla, а также лигирование их продуктов к плазмиде PGEX-6P-2 (полученной коммерчески; см. таблицу материалов). Экран с векторным штаммом Xl/blue кишечной палочки.
- Трансформируйте положительный клон в компетентные клетки E. coli BL21 (см. Таблицу материалов) и амплифицируйте с помощью акульей культуры.
- Экспрессируйте антиген и изолируйте после индукции с помощью изопропил-β-D-1-меркаптогалакпиранозида и изолятов мультимодальной хроматографии (ММК) (см. Таблицу материалов).
- Охарактеризуйте антигенный белок и очистите его с помощью полностью автоматизированного очистителя.
- Аффинно очищайте белки, меченные гутатион-S-трансферазой (GST), из очищенных лизатов с помощью коммерчески доступной смолы аффинной хроматографии (см. Таблицу материалов).
- Очистите рекомбинантные белки с помощью изопропил-β-D-1-меркаптогалакпиранозида и мультимодальной хроматографии (ММК).
- Удалите эндотоксин методом фазового разделения Triton X-114. Кратко смешайте 1% Triton X-114 с элюированием рекомбинантного белка при 0 °C в течение 5 минут, чтобы получить однородный раствор, и инкубируйте при 37 °C в течение 5 минут, чтобы образовались две фазы.
- Используйте метод тестирования бактериального эндотоксина с наборами Turtle (см. Таблицу материалов) для определения концентрации эндотоксина. Содержание эндотоксина для белкового антигена составляет 0,06 EU/μg, что ниже международного стандарта (1,5 EU/μg).
- Проведите испытание на интерференцию, чтобы исключить возможное влияние испытуемого продукта на обнаружение эндотоксина.
заметка: Согласно Приложению 2020 Китайской фармакопеи, содержание эндотоксина должно быть менее 5 ЕД/доза. Чувствительность лизата лимулюса (λ0,25 ЕУ/мл) и максимальный эффективный коэффициент разведения 33,3 рассчитывали на основе максимально валидного разведения, MVD = cL/λ, где L – предельное значение бактериального эндотоксина для испытуемого изделия, c – концентрация раствора исследуемого изделия, а когда L выражается в ЕВ/м, c равно 1,0 мг/мл. λ — меченая чувствительность (EU/mL) реагента мечехвоста в гелевом методе.
- Рекомбинируйте антиген (48 кДа, определяемый с помощью 12% электрофореза в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида [SDS-PAGE]) в концентрации 1,5 мг/мл в стерильной воде без эндотоксина или фосфатно-солевого буфера (PBS) (метод дихлората натрия).
ПРИМЕЧАНИЕ: Время пика белка составило 13,843 мин, чистота составила 99,4% (метод высокоэффективной жидкостной хроматографии), белок хранился при температуре -70 °C. В качестве ПЦР-матрицы использовали геномную ДНК, выделенную из штамма S. aureus MRSA252 (см. Таблицу материалов). Ген IsdB амплифицировали с помощью прямого праймера 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
С-39 и обратный капсюль 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTTTATTAGATTCTTC-39.
Ген Hla амплифицировали с помощью прямого праймера PHLAF (GCGGATCCGATTGATATTAATATTAAAACC) и обратного праймера PHLAR (TAAGCGGCCGCTTATCAATTTGTCATTTCTTC).
2. Приготовление наноэмульсионной вакцины
- В соответствии с массовым соотношением 1:6:3 (масса/масса) добавьте последовательно три вида вспомогательных веществ (изопропилмиристат, полиоксиэтиленкасторовое масло и пропиленгликоль; см. таблицу материалов) в раствор белка антигена HI (10 мг/мл) и хорошо перемешайте. Затем добавьте постепенно стерилизованную чистую воду до конечного объема 10 мл и перемешайте при 500 об/мин и 25 °C в течение примерно 20 мин.
заметка: Наноэмульсия, полученная по этому протоколу, имеет объем 10 мл, а массы трех вспомогательных веществ составляют 0,34 г, 2 г и 1 г соответственно. Белковый раствор здесь является рабочим раствором, концентрацией которого в 10 раз больше конечного раствора.
- Приготовьте наноэмульсионную адъювантную вакцину (1 мг/мл белка) методами низкоэнергетического эмульгирования для получения прозрачного и прозрачного жидкого раствора><.
заметка: Заготовку наноэмульсии (БНЭ) готовили аналогичными методами, за исключением того, что воду заменяли на HI. Обычный метод эмульгирования включает в себя нагрев наружной и внутренней фаз примерно до 80 °C для эмульгирования, а затем их постепенное перемешивание и охлаждение. В этом процессе расходуется большое количество энергии, и, наконец, получается эмульсия.
3. Физические характеристики и стабильность вакцины с наноэмульсионным адъювантом
- Размер частиц, дзета-потенциал и характеристика индекса дисперсии полимера (PDI).
- Приготовьте 100 мкл наноэмульсионной адъювантной вакцины и разбавьте водой для инъекций в 50 раз. Добавьте 2 мл образца для обнаружения.
- Наблюдайте за размерами частиц, дзета-потенциалом и PDI при 25 °C с помощью нанозетазера (ZS; см. Таблицу материалов).
- Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
- 10 μл наноэмульсионной вакцины развести в 50 раз с водой, поместить на медную сетку с углеродным покрытием 100 меш и окрашивать 1% фосфовольфрамовой кислотой (см. Таблицу материалов) в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Удалите излишки раствора фосфовольфрамовой кислоты с помощью фильтровальной бумаги.
- Рассмотрите морфологию под просвечивающим электронным микроскопом (см. Таблицу материалов). Изучите, являются ли готовые изделия почти стабильными и круглыми в поле зрения электронного микроскопа и демонстрируют ли они хорошую дисперсию.
- Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
- 10 л наноэмульсионной адъювантной вакцины разбавить водой в 50 раз, капнуть 10 л предварительно разведенных образцов на кремниевую пластину и поместить в инкубатор с термостатом при температуре 37 °C на 24 ч.
- Распылите подготовленную платину на кремний в течение 40 с и охладите до комнатной температуры.
- Наблюдайте за морфологическими свойствами подготовленных образцов под сканирующим электронным микроскопом высокого разрешения (см. Таблицу материалов). Определите, являются ли образцы почти стабильными, сферическими и хорошо диспергированными в поле зрения под электронным микроскопом.
- Морфологическая стабильность
- Поместите 1 мл образцов наноэмульсионных вакцин в микроцентрифужные пробирки и оцените стабильность свежих образцов путем центрифугирования в течение 30 мин при 13 000 x g при комнатной температуре (25 ° C).
- Понаблюдайте за внешним видом этих свежих образцов, а затем проведите испытание на термодинамическую стабильность, состоящее из шести температурных циклов (один цикл: хранить при 4 °C в течение 48 часов, 25 °C в течение 48 часов и 37 °C в течение 48 часов).
- После центрифугирования дайте образцам постоять 15 минут, чтобы определить, есть ли эффект Тиндаля (является ли образец прозрачным и прозрачным на свету) и произошла ли деэмульгация (о чем свидетельствует четкая стратификация после деэмульгирования).
- SDS-PAGE и вестерн-блот
- Встряхните образцы, смешайте раствор из 0,6 мл абсолютного этанола и 0,3 мл вакцины и запустите центрифугу (13 000 х г, 30 мин при комнатной температуре, 25 °С).
- Переложите надосадочную жидкость раствора в чистую пробирку и растворите осадок с 0,3 мл воды. Растворы надосадочной жидкости и осадка (как пустой наноэмульсии, так и вакцины) получают после обработки абсолютным этанолом и раствором дистиллированной воды и проводят такое же 50-кратное разбавление.
- Смешайте 2,5 мл разделительного геля А и 2,5 мл разделительного геля В (см. Таблицу материалов), добавьте 50 мл 10% персульфата аммония и быстро поместите раствор в стеклянную пластину с помощью пипетки. Смешайте 1 мл концентрированного геля А и 1 мл концентрированного геля В, добавьте 20 мл 10% персульфата аммония в стеклянную пластину, вставьте гребень соответствующего размера и дождитесь застывания.
- Добавьте в общей сложности 5 мкл 5-кратного загрузочного буферного раствора к разбавленному образцу, полученному на шаге 3.5.2, и кипятите образец в течение 5 минут.
- Добавьте в соответствующую лунку 10 мкл нагретого белка, а в маркерную лунку добавьте 5 мкл белкового маркера.
- Подсоедините электрод, включите измеритель электрофореза (см. Таблицу материалов) и отрегулируйте напряжение до 300 В. Отключите питание, когда электрофорез достигнет 1 см от нижней части резины PAGE.
- Удалите гель и смойте водой двойной дистилляции (ddH2O). Добавьте ярко-синий раствор для окрашивания Coomassie G-250 (см. Таблицу материалов) на 10 минут. Вылейте раствор для окрашивания, дважды промойте гель раствором и коммерчески доступным раствором для обесцвечивания и разогрейте гель в микроволновой печи в течение 1 минуты. Встряхивайте гель в течение 10 минут и многократно меняйте раствор для обесцвечивания, пока фон геля не станет чистым. Затем выполните визуализацию гелем (см. Таблицу материалов).
заметка: Вестерн-блот предварительно обрабатывали, как описано в шагах 3.5.1-3.5.6.
- Пропитайте три блока фильтровальной бумаги буфером для переноса электрофореза. Замочите мембрану из поливинилиденфторида (ПВДФ) в метаноле на 30 с и перенесите с помощью полусухого гелеобразного инструмента для переноса (два слоя фильтровальной бумаги, мембрана из ПВДФ, гель для электрофореза и один слой фильтровальной бумаги). Используйте напряжение 23 В для переноса мембраны в течение 23 минут.
- Снимите мембрану из ПВДФ и промойте один раз трис-буферным физиологическим раствором Tween 20 (TBST) после переноса.
- Поместите мембрану PVDF в герметизирующий раствор (5% раствор сухого обезжиренного молока) и запечатайте на ночь при температуре 4 °C.
- Снимите мембрану PVDF и промойте три раза TBST или по 10 мин каждый.
- Инкубировать с первичным антителом (от иммунизированных мышей с положительным результатом теста на сыворотку). Разбавляйте исследуемое первичное антитело (см. Таблицу материалов) в 500 раз (100 раз) с помощью TBST. Поместите заблокированную мембрану PVDF в первичное антитело и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
- Снимите мембрану из ПВДФ и трижды промойте TBST по 10 минут каждый.
- Инкубируйте с вторичным антителом (см. Таблицу материалов). Разведенное меченное щелочной фосфатазой (АФ) козье вторичное антитело против мышей в 5000 раз с помощью TBST. Поместите мембрану PVDF во вторичное антитело и инкубируйте при 37 °C в течение 40 минут.
- Снимите мембрану PVDF и промойте четыре раза TBST по 10 минут каждый.
- Погрузите мембраны PVDF в смесь (ровно столько, чтобы пропитать мембрану) субстрата AP нитросинего тетразола (NBT) и BCIP (5-бром-4-хлор-3'-индолифосфат-толуидиновая соль) (см. Таблицу материалов) для окрашивания. Положительный результат фиолетовый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты должны иметь четкую фиолетовую полосу, а полоска образца и молекулярная масса антигена должны находиться в одном и том же маркированном положении.
4. Оценка иммунного ответа антител на данную вакцину после внутримышечного введения
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были иммунизированы путем внутримышечной инъекции наноэмульсионной вакцины после опубликованного отчета. Мышам вводили PBS в качестве отрицательного контроля. Через 1 неделю после завершения трех иммунизаций у мышей собирали сыворотку крови. Сывороточные уровни IgG и подклассов IgG1, IgG2a и IgG2b количественно определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).
- Антигенное покрытие: Разбавьте антиген белка HI до 10 мкг/мл с раствором покрытия и добавьте в планшет ИФА в концентрации 100 мкл/лунка. Инкубировать при температуре 4 °C в течение ночи.
заметка: Раствор покрытия готовят путем растворения 1,6 г безводного карбоната натрия и 2,9 г гидрокарбоната натрия в 1 л деионизированной воды.
- Герметизация: Промойте пластину (три цикла, каждый цикл 300 μл). Добавьте 300 μL герметизирующего раствора в каждую лунку и загерметизируйте лунки на 2 ч при 37 °C.
заметка: Герметизирующий раствор готовят путем добавления Tween-20 и бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS. Содержание БСА в растворе PBST составляет 1%.
- Разведение сыворотки: Разведите образец сыворотки мышей в 100 раз с PBST (возьмите 3 μL сыворотки и добавьте ее к 297 μL PBST и вортекса) и используйте 100 μL для каждого образца сыворотки. Положительную сыворотку и отрицательную контрольную сыворотку разбавляют ПБСТ в 100 раз, добавляя от 4 до 396 мл ПБСТ, затем перемешивают путем вортексирования.
- Двойное соотношение: Добавьте 200 мкл вышеразведенной экспериментальной сыворотки в первый ряд пластины с покрытием для ИФА и добавьте 100 мкл PBST во все лунки, кроме первого и12-го рядов. Последовательно выполняйте разведение в соотношении 1:2 от первого ряда: отрегулируйте дозатор до 100 μл, переведите 100 μЛ из первого ряда во второй ряд и перемешайте с пипеткой 10 раз.
- Разбавьте сыворотку до ряда 11 в нескольких соотношениях и слейте 100 мкл жидкости.
- Разбавленную отрицательную и положительную сыворотку добавить в соответствующие лунки в строке 12 согласно шаблону образца (см. табл. 1)-100 мкл/лунка.
- Запечатайте планшеты ИФА полиэтиленовой пленкой и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 1 часа.
- Разведите вторичное антитело против мышей IgG-HRP (см. Таблицу материалов) с PBST в соотношении 1:10 000.
- Вымойте тарелку (три цикла, каждый цикл 300 μл). Затем добавьте по 100 мкл разведенного вторичного антитела в каждую лунку и инкубируйте планшет при 37 °C в течение 40 минут.
- Окрашивание и окончание: Вымойте пластину (пять циклов, каждый цикл 300 μл). Добавьте в каждую лунку раствор для окрашивания 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) (100 μл; см. Таблицу материалов). Поместите планшеты при температуре 37 °C на 10 минут вдали от света, а затем немедленно завершите реакцию 50 μL 2 M H2SO4.
- Определите значение оптической плотности (OD450) с помощью ферментного маркера (считайте значение OD450 в течение 15 минут после терминации).
Таблица 1: Последовательность спайков ELISA и шаблон разведения.
