Оценка каспазо-опосредованного расщепления вирусных белков и белков хозяина в инфицированных вирусом клетках

Аннотация

Источник: Husain, M. Идентификация каспаз и их мотивов, которые расщепляют белки во время инфекции, вызванной вирусом гриппа А.J. Vis. Exp. (2022)

В видео демонстрируется метод оценки расщепления белка, опосредованного каспазами, в клетках, инфицированных вирусом. После вирусной инфекции каспазы активируются и разрушают различные клеточные белки хозяина и вирусные нуклеопротеины, в то время как специфические ингибиторы каспазы предотвращают эту деградацию, что подтверждается вестерн-блоттингом.

Протокол

1. Оценка расщепления или деградации белков в клетках вируса гриппа А, инфицированных IAV, с помощью каспаз

1. Засейте 3 x 10⁵ клеток Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) или A549 в лунку в 12-луночном планшете для культивирования клеток.
   заметка: При использовании клеток MDCK убедитесь, что антитело против интересующего белка распознает его собачью разновидность.
2. Засейте лунки парами, т.е. контрольную пару - одну лунку для неинфицированного фиктивного образца и одну - для инфицированного фиктивного образца, тестовую пару - одну лунку для неинфицированного образца ингибитора А и одну лунку для инфицированного образца ингибитора А. Увеличивайте количество пар с каждым дополнительным ингибитором.
3. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в атмосфере 5%_CO2 в течение ночи.
4. На следующий день заразите клетки IAV (подтип H1N1 или другой подтип).
   1. Для этого готовят вирусный посев путем разбавления вирусного запаса в 400 мкл бессывороточной минимально необходимой среды (МЭМ) (см. Таблицу материалов) при кратности инфекции (MOI) 0,5-3,0 бляшкообразующих единиц (БОЕ)/клетка (коэффициент удвоения числа клеток при расчете MOI).
      заметка: Для инфицирования клеток MDCK добавьте в посевной посев вируса тозилфенилаланилхлорметилкетон (TPCK)-трипсин в конечной концентрации 1 мкг/мл.
5. Удалите старую питательную среду из клеток (шаг 1.3) и промойте клетки 1 мл бессывороточного MEM 2x.
6. Добавьте в клетки 400 μл вирусного инокулята (шаг 1.4.1) и инкубируйте их в течение 1 ч при 35 °C в атмосфере с содержанием 5% углекислого газа (CO₂).
7. В то же время разбавьте ингибитор каспазы (например, Z-DEVD-FMK), ингибитор лизосом (например, хлорид аммония, NH₄Cl) или ингибитор протеасомы (например, MG132) (см. Таблицу материалов) в конечной концентрации 40 мкМ, 20 мМ или 10 мкМ, соответственно, в бессывороточных МЭМ (см. Таблицу материалов) (см. Таблицу материалов)). Последние два ингибитора служат в качестве контроля. Разбавьте равное количество растворителя (если он не является водой), используемого для восстановления одного из ингибиторов в среде, не содержащей сыворотки, в качестве макета.
8. Удалите вирусный посев и промойте клетки, как в шаге 1.5 (1x).
9. Добавьте в клетки бессывороточный МЭМ, 1 мл на лунку, макет или с добавкой ингибитора, и инкубируйте клетки, как описано в шаге 1.6. Этот момент времени рассматривается как 0 ч заражения.
10. Через 24 ч соберите клетки, соскоблив их с помощью поршня шприца объемом 1 мл (резиновая сторона), и перенесите их в полипропиленовую трубку объемом 1,5 мл.
11. Центрифугируйте пробирку при давлении 12 000 x g в течение 1-2 минут при комнатной температуре. Соберите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
    заметка: Этот надосадочный агент может быть отброшен или использован для анализа бляшек для измерения титра высвобожденного вирусного потомства.
12. Промойте клеточную гранулу 250 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) путем повторного центрифугирования, как показано на шаге 1.11.
13. Удалите надосадочную жидкость и лизируйте клетки, добавив 80-100 мкл буфера для лизиса клеток (50 мМ трис (гидроксиметил) аминометана (ТАМ), гидрохлорида (Tris-HCl), pH 7,4, 150 мМ хлорида натрия (NaCl), 0,5% додецилсульфата натрия (SDS), 0,5% дезоксихолата натрия, 1% Triton X-100 и 1x коктейля ингибиторов протеазы, см. Таблицу материалов) и вортексирования.
14. Нагрейте пробирку до 98 °C в течение 10 минут для полного лизата и приготовления общего лизата клеток. Храните лизаты при температуре 4 °C для выполнения шагов 1,15-1,17 на следующий день, но для достижения наилучших результатов завершите эти шаги в тот же день.
15. Оцените количество белка в каждом образце с помощью набора для табличного анализа бицинхониновой кислоты (BCA) (см. Таблицу материалов).
16. Разрешите равное количество белка из неинфицированных и инфицированных образцов с помощью стандартного электрофореза в виде полиакриламидного геля SDS (SDS-PAGE) вместе с маркерами молекулярной массы.
17. Перенесите белок на мембрану из нитроцеллюлозы или поливинилидендифторида (PVDF) (см. Таблицу материалов).
    заметка: Мембрана из ПВДФ может давать высокий фон в некоторых западных блот-сканерах; Проверьте на совместимость.
18. Проведите вестерн-блоттинг для обнаружения интересующего белка с помощью метода, описанного в другом месте.
19. Сравните уровни белка в инфицированных образцах, обработанных имитацией и ингибиторами.
    заметка: Если уровень белка восстановился в инфицированной полосе образца, обработанной ингибитором каспазы, то белок расщепляется или разрушается под действием каспаз. В противном случае он разрушается либо лизосомой, либо протеасомой.
20. Количественно оцените восстановление белка путем измерения интенсивности его полосы в каждой полосе по меньшей мере из трех повторов одного и того же эксперимента и нормализации его с помощью соответствующей контрольной полосы нагрузки.
21. Используйте любой современный имидж-сканер и связанное с ним программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для визуализации вестерн-блоттинга и количественной оценки восстановления белка.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ячейки А549	АТКС	Система CRM-CCL-185	Человеческий, эпителиальный, легочный
нашатырь	Сигма-Олдрич	А9434
Ингибитор каспазы 3	Сигма-Олдрич	264156-М	Также известен как 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
Полный мини-коктейль ингибиторов протеазы	Рош	11836153001
Козьи антитела к NP			Подарок от Ричарда Уэбби (Детская исследовательская больница Святого Иуды, Мемфис, США) MH
Клетки MDCK	АТКС	БКЛ-34	Собачий, эпителиальный, почковый
МГ132	Сигма-Олдрич	М7449
Минимально необходимая среда (MEM)	ThermoFisher Scientific	11095080	Добавьте L-глютамин, антибиотики или другие добавки по мере необходимости
Имидж-сканер Odyssey Fc с программным обеспечением Image Studio Lite 5.2	ЛИТИЙ-КОР		Odyssey Fc был заменен на Odyssey XF, а программное обеспечение Image Studio Lite было заменено на программное обеспечение Empiria Studio.
Набор для анализа белка BCA от Pierce	ThermoFisher Scientific	No 23225
Нитроцеллюлозная мембрана Protran Premium	Цитива (Fomerly GE Healthcare)	10600003
Антитела к актину кролика	Абкам	АБ8227
Антитела к кортактину кролика	Клеточная сигнализация	No 3502
Стандарт предварительно окрашенного белка SeeBlue	ThermoFisher Scientific	ЛК5625
Tris-HCl, NaCl, SDS, дезоксихолат натрия, Triton X-100	Мерк
Трипсин, обработанный TPCK	Сигма-Олдрич	4370285